編者：資源增量是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技發(fā)展的核心任務(wù)，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對生命科學(xué)研究提供支撐和服務(wù)的基礎(chǔ)和保障。自上世紀(jì)80年代以來，我國老一輩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)家苦心孤詣，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研發(fā)工作中取得的多項(xiàng)開創(chuàng)新成果。
1988年《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》發(fā)布實(shí)施，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作規(guī)范化、法制化管理，保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量，推動(dòng)我國科技發(fā)展和民生保障等方面發(fā)揮了重要作用。特別是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源標(biāo)準(zhǔn)化、新品種/品系開發(fā)和動(dòng)物模型創(chuàng)制方面，取得了令人矚目的成果。
為此，借“科技資訊”之窗，陸續(xù)推出我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專家在此領(lǐng)域所作的工作及取得的應(yīng)用成果。
無菌豬培育的標(biāo)準(zhǔn)化研究與應(yīng)用展望
孫靜， 劉作華，葛良鵬
（1．重慶市畜牧科學(xué)院，重慶402460）（2.農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶402460）
（3.重慶市養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶402460）（4.醫(yī)用動(dòng)物資源開發(fā)與利用技術(shù)工程中心，重慶402460）
無菌豬是通過對符合標(biāo)準(zhǔn)的供體母豬進(jìn)行無菌剖腹產(chǎn)，獲得無菌仔豬，并將其飼養(yǎng)在無菌隔離器內(nèi)，呼吸無菌的空氣，食用無菌的飲水和食物，培育出的利用現(xiàn)有技術(shù)不能檢測出任何活的微生物的一種特殊模式動(dòng)物［1］。由于其微生物背景清晰，是研究菌群相關(guān)疾病不可多得的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。同時(shí)，其嚴(yán)格的微生物控制也為豬源性生物醫(yī)藥產(chǎn)品的開發(fā)提供了生物安全保障。
無菌豬培育的標(biāo)準(zhǔn)化研究，旨在實(shí)現(xiàn)無菌豬資源的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化應(yīng)用轉(zhuǎn)化與可持續(xù)發(fā)展，保證批量化供應(yīng)合格的無菌豬資源，保障無菌豬相關(guān)研究結(jié)果準(zhǔn)確性、重復(fù)性和可靠性。本文結(jié)合課題組在無菌豬培育方面的多年工作積累，就無菌豬培育的標(biāo)準(zhǔn)化研究，包括環(huán)境、營養(yǎng)、微生物等標(biāo)準(zhǔn)化控制進(jìn)行探討，并就無菌豬在畜牧、食品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行展望。
1無菌豬培育標(biāo)準(zhǔn)化研究
1.1環(huán)境條件標(biāo)準(zhǔn)化研究
環(huán)境條件標(biāo)準(zhǔn)化是無菌豬標(biāo)準(zhǔn)化培育的基礎(chǔ)，主要包括無菌豬培育的屏障環(huán)境設(shè)施和無菌豬生產(chǎn)專用設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)化。
1.1.1無菌豬培育的屏障環(huán)境設(shè)施
無菌豬培育的環(huán)境屏障設(shè)施須遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施建筑技術(shù)規(guī)范》（GB 50447-2008），《潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境國際標(biāo)準(zhǔn)》（ISO 14644）以及《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 環(huán)境及設(shè)施》（GB 14925- 2010）進(jìn)行修建。要求環(huán)境潔凈度達(dá)到7級、溫度維持在20℃-26℃、空氣濕度維持在40%-70%之間。
1.1.2無菌豬生產(chǎn)專用設(shè)備的標(biāo)準(zhǔn)化
經(jīng)過多年的實(shí)踐和摸索，重慶市畜牧科學(xué)院自主設(shè)計(jì)并委托成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司制作了無菌豬培育的關(guān)鍵設(shè)備，包括豬用無菌子宮剝離器、無菌豬運(yùn)輸隔離器和無菌豬飼養(yǎng)隔離器，并制定了《無菌豬 飼養(yǎng)隔離器》（Q-BSD 4-2016），《無菌豬 子宮剝離器》（Q-BSD 5-2016）和《無菌豬 無菌運(yùn)輸器》（Q-BSD 6-2016）三個(gè)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，以保證無菌豬從獲取、運(yùn)輸、飼養(yǎng)過程始終處于無菌環(huán)境。目前，此三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)已完成重慶市地方標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)。
1.2無菌豬營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化研究
商業(yè)化乳豬奶粉經(jīng)Co60輻照并微生物檢測合格后均可飼喂無菌仔豬。斷奶階段（≥21日齡后），可逐漸換為滅菌的粉狀飼料，濕拌料更利于仔豬的采食，減少浪費(fèi)。本平臺(tái)制定了Q-BSD 2-2016《無菌豬 代乳料》企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定了其衛(wèi)生要求、檢驗(yàn)規(guī)則、包裝、貯存和保質(zhì)期等技術(shù)要求。
1.3無菌豬微生物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究
無菌豬的微生物質(zhì)量控制包括供體母豬的質(zhì)量控制和無菌仔豬質(zhì)量控制兩部分。
1.3.1供體母豬的微生物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
供體豬要求臨床上排除經(jīng)胎盤垂直傳播的四種疾病，包括豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合癥、豬偽狂犬病和豬細(xì)小病病毒[2]。
1.3.2無菌豬的微生物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)
由于我國暫未頒布無菌豬微生物檢測標(biāo)準(zhǔn)。本平臺(tái)也建立了一套無菌豬樣品采集與送檢的標(biāo)準(zhǔn)操作SOP，包括動(dòng)物樣品采集與送檢的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、隔離器內(nèi)環(huán)境樣品的采集與送檢的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、動(dòng)物和環(huán)境樣本的微生物檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程；同時(shí)，建立了一套無菌豬微生物學(xué)監(jiān)測的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（Q-BSD 3-2016）。
1.4無菌豬培育標(biāo)準(zhǔn)操作SOP的建立
為最大限度地避免因人為操作不規(guī)范，造成屏障設(shè)施或隔離器運(yùn)行不正常和無菌豬污染事件的發(fā)生，建立一套行之有效的屏障設(shè)施運(yùn)行管理與標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，才能確保無菌豬的應(yīng)用需求。
參考《SPF豬病原的控制與監(jiān)測》（GBT 22914-2008）、《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 微生物學(xué)等級及監(jiān)測》（GB 14922.2-2011）、《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 寄生蟲等級檢測》（GB 14922.1-2011）和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無菌動(dòng)物生活環(huán)境及糞便標(biāo)本的檢測方法》（GBT 14926.41-2001）等無菌動(dòng)物質(zhì)量管理國家標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合無菌豬自身的特性和培養(yǎng)過程的實(shí)際情況。本實(shí)驗(yàn)室建立了一套無菌豬生產(chǎn)管理和標(biāo)準(zhǔn)操作SOP，包括屏障環(huán)境獲取與維持的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、隔離器清潔與滅菌操作規(guī)程、物品滅菌的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、空氣過濾模塊更換操作規(guī)程、動(dòng)物清潔與消毒的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、動(dòng)物進(jìn)出手術(shù)室的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、動(dòng)物麻醉藥的標(biāo)準(zhǔn)使用規(guī)程、子宮剖除術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、無菌新生仔豬發(fā)生異常時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、死亡動(dòng)物尸體處置的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、處置實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和異常死亡動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、動(dòng)物樣品采集與送檢的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、隔離器內(nèi)環(huán)境樣品的采集與送檢的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、動(dòng)物和環(huán)境樣本的微生物檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程等。以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的目的。
SOP的實(shí)施須“以人為本”，要求飼養(yǎng)管理人員和檢驗(yàn)技術(shù)人員應(yīng)嚴(yán)格遵守，未經(jīng)有關(guān)SOP培訓(xùn)的不能上崗。
2無菌豬的應(yīng)用展望
2.1畜牧生產(chǎn)領(lǐng)域
早期無菌豬培育的目的主要是為了進(jìn)行種豬的疫病凈化，隨著豬克隆技術(shù)的不斷成熟，利用克隆和無菌豬培育相結(jié)合是進(jìn)行種豬疫病凈化的有效途徑。一些種豬生產(chǎn)性能優(yōu)異，但由于各種原因感染某些疾病，不宜繼續(xù)作為種用，則可以通過從種豬上分離細(xì)胞，經(jīng)檢測細(xì)胞無特定感染后，即可通過克隆和無菌凈化的方法重新克隆獲得種豬，延長其種用價(jià)值。
無菌豬和普通豬的比較研究發(fā)現(xiàn)，兩者在腸道小腸絨毛結(jié)構(gòu)和免疫系統(tǒng)發(fā)育方面存在較大的差異[3，4]，提示菌群對豬的營養(yǎng)吸收和抗病力影響較大。因此，利用無菌豬模型，開展豬的營養(yǎng)代謝和抗病力研究，研發(fā)新型飼料或添加劑，降低養(yǎng)豬生產(chǎn)中的獸藥用量，是一個(gè)非常重要的研究方向。此外，由于未受任何病原微生物感染，無菌豬的血清也是相關(guān)疾病診斷試劑盒的優(yōu)質(zhì)陰性血清。
2.2特殊膳食產(chǎn)品的開發(fā)
腸道菌群和營養(yǎng)物質(zhì)吸收和免疫系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)，同時(shí)，豬的腸道結(jié)構(gòu)、消化生理、代謝特性等與人類相似性較大。因此，將無菌豬接種不同類型人群的腸道菌群，模擬其消化代謝特點(diǎn)，可針對性的開發(fā)適于不同人群的特殊膳食產(chǎn)品。
例如，可將嬰幼兒的腸道菌群接種到無菌豬的體內(nèi)，模擬其消化吸收特點(diǎn)和免疫系統(tǒng)的發(fā)育，開展兒童疫苗、嬰幼兒奶粉的質(zhì)量評價(jià)，或開展嬰幼兒食物過敏相關(guān)研究，開發(fā)特殊嬰幼兒食品。此外，腫瘤放化療患者腸道菌群受放化療影響較大，可將其移植至無菌豬體內(nèi)，特異性開發(fā)適宜腫瘤放化療患者消化吸收的特殊食品，改善其抵抗力，幫助疾病的恢復(fù)。同樣的原理，可針對不同腸道菌群相關(guān)的疾病，特異性的利用無菌豬建立其對應(yīng)的腸道菌群模型，研究其消化吸收特性，對應(yīng)的開發(fā)一類特殊膳食產(chǎn)品，通過飲食調(diào)理協(xié)助病人康復(fù)。
2.3生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用
越來越多的研究表明，腸道菌群與高血壓、糖尿病、自身免疫疾病、以及抑郁等疾病均有相關(guān)性。而將菌群與疾病的相關(guān)性研究推進(jìn)到因果性研究水平，無菌豬是一個(gè)非常適宜的動(dòng)物模型。與常用的嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比，豬在生理和遺傳上與人類更為相似[5，6]，由于其背景微生物清晰，可清晰的闡述移植的菌群與表型的因果關(guān)系，特別是將無菌豬與基因編輯豬相結(jié)合，可進(jìn)一步闡明菌群－基因－宿主三者之間的作用，為腸道菌群為靶點(diǎn)的疾病診療新技術(shù)、新產(chǎn)品的開發(fā)和評價(jià)提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物支撐。利用無菌動(dòng)物技術(shù)“轉(zhuǎn)入”（菌群移植）和“敲除”（動(dòng)物無菌化）特定菌群，有助于解析眾多疾?。ㄈ鐑和蚤]癥、自身免疫疾病和炎癥性腸病等）的發(fā)病機(jī)理或菌群對疾病的影響。比如，由于剖腹產(chǎn)手術(shù)獲取的無菌仔豬未接觸母源抗體和免疫細(xì)胞，這樣的免疫功能不全的豬模型顯然是一種合適的動(dòng)物模型，可幫助理解和調(diào)查早產(chǎn)兒的健康狀況[7]；或建立菌群、營養(yǎng)和治療干預(yù)手段，達(dá)到改善其器官或免疫系統(tǒng)等發(fā)育。
利用無菌豬進(jìn)行人體細(xì)胞／組織／器官的培養(yǎng)，將是未來人體器官私人定制的重要發(fā)展方向。通過基因編輯技術(shù)，可阻斷豬特定器官的發(fā)育，將人自體干細(xì)胞植入器官發(fā)育阻斷的豬的胚胎或胎兒體內(nèi)，有望利用人干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)器官發(fā)育補(bǔ)償，在動(dòng)物體內(nèi)生長出人類的細(xì)胞／組織／器官，實(shí)現(xiàn)人體器官的私人定制。在此研究過程中，利用無菌豬一方面可保障豬源性產(chǎn)品的生物安全性，另一方面，在某些研究階段，需要將人類細(xì)胞植入免疫缺陷豬的體內(nèi)以避免免疫排斥，而免疫缺陷豬[8]只有在無菌狀態(tài)才能健康生長。
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