更新時(shí)間：2019-02-11, 來源：國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專家委員會(huì)簡(jiǎn)報(bào) 2019年第7期2227
編者：1988年《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》發(fā)布實(shí)施，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作規(guī)范化、法制化管理，保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量，推動(dòng)我國(guó)科技發(fā)展和民生保障等方面發(fā)揮了重要作用。特別是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源標(biāo)準(zhǔn)化、新品種/品系開發(fā)和動(dòng)物模型創(chuàng)制方面，取得了令人矚目的成果。
資源增量是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技發(fā)展的核心任務(wù)，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)生命科學(xué)研究提供支撐和服務(wù)的基礎(chǔ)和保障。自上世紀(jì)80年代以來，我國(guó)老一輩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)家苦心孤詣，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研發(fā)工作中取得的多項(xiàng)開創(chuàng)新成果。在“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2017YFD0501606）和中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)項(xiàng)目課題的支持下，以景志忠教授為首的研究團(tuán)隊(duì)在實(shí)驗(yàn)用合作小型豬培育與抗病免疫分子遺傳特性研究與應(yīng)用方面開展的深入研究。
為此，借“科技資訊”之窗，介紹該項(xiàng)目所取得的成果。
實(shí)驗(yàn)用合作小型豬培育與抗病免疫分子遺傳特性研究應(yīng)用現(xiàn)狀
景志忠 陳國(guó)華 賈懷杰 房永祥 何小兵
中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
合作豬，又稱蕨麻豬（因采食蕨麻而得名），也稱藏豬或山豬，是甘肅、青海、四川、云南、西藏等藏族地區(qū)飼養(yǎng)的一種小型原始地方豬品種。合作豬主要分布在甘肅省西南部、青藏高原的東部邊緣，中心產(chǎn)區(qū)在甘南藏族自治州的合作市以及周邊的夏河、碌曲、卓尼等縣，因而1984年被定名為合作豬[1]。
一、合作豬的基本特性與利用優(yōu)勢(shì)
（一）品種形成環(huán)境與特點(diǎn)
由于長(zhǎng)期生存在惡劣高寒氣侯(海拔3000 m左右，最低氣溫-28℃,最高氣溫27.7℃，年平均溫度 1-7 ℃，溫差較大)和低劣的飼養(yǎng)條件下(終年以放牧為主，采食蕨麻等牧草的根、莖、籽及農(nóng)作物的秸稈等), 具有許多適應(yīng)高原環(huán)境的特點(diǎn),即具有良好利用野生植物的能力，體質(zhì)結(jié)實(shí)、四肢健壯、性野、行動(dòng)敏捷、鬃長(zhǎng)和絨毛密生等特點(diǎn)。其次，由于地處偏僻山村，交通不便,長(zhǎng)期自繁自養(yǎng)封閉繁殖，未受外來血緣的影響, 形成了一個(gè)遺傳相對(duì)穩(wěn)定、均一的原始地方豬種。其三，合作豬體型小、生長(zhǎng)緩慢,在畜牧業(yè)生產(chǎn)中使用價(jià)值不大。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，甘南州“合作豬”的數(shù)量?jī)H有6萬(wàn)多頭 ，而且大部分地區(qū)的合作豬已被雜交，豬種血緣混亂，致使這一珍貴種質(zhì)資源瀕臨滅絕，亟待保護(hù)[2,3,4]。近年來，隨著合作豬生物學(xué)價(jià)值和食用價(jià)值被重新認(rèn)識(shí)，合作豬優(yōu)秀的抗逆性和肉質(zhì)特征以及適于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化培育的優(yōu)勢(shì)，成為未來發(fā)展的趨勢(shì)。
（二）品種基本特征
合作豬體型較小，性情野，行為機(jī)靈活潑[2,3,4]。合作豬毛色純黑的少，一般四肢、腹部、背部等部位為白色，被毛粗密而長(zhǎng)，冬生棕色絨毛，鬃長(zhǎng)且堅(jiān)韌。初生仔豬背部毛色帶有棕黃色或褐色縱行條紋（松鼠背色），隨日齡增長(zhǎng)而逐漸消失。合作豬頭窄長(zhǎng)，呈錐形，嘴長(zhǎng)而尖，犬齒發(fā)達(dá)，耳小向上直立，額無明顯皺紋，頸和體軀較短，胸較狹窄，背腰平直或微弓，后軀較前軀略高，臀窄而傾斜，四肢長(zhǎng)短適中，健壯，跟系短而有力，蹄小堅(jiān)實(shí)；乳頭 4-6 對(duì)，排列整齊。成年公豬體重約33.31kg，母豬約34.84 kg。母豬 4-5月齡開始配種，產(chǎn)仔數(shù)較少（平均3.6頭），繁殖率較低。合作豬日增重較低，約210.01 g/d，料肉比偏高達(dá)3.51。
（三）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化前景
合作豬體型小，易于進(jìn)行微生物控制, 可培育成國(guó)際上最小的實(shí)驗(yàn)用小型豬。合作豬品種純，遺傳穩(wěn)定。由于合作豬分布在偏僻的高原地帶, 很少受外來血緣的影響, 同時(shí)在畜牧業(yè)生產(chǎn)中, 因其體型小、繁殖性能較低, 一般未能進(jìn)行雜交改良用于畜牧業(yè)生產(chǎn), 保存了原始的均一的矮小基因庫(kù)，且其遺傳背景比較清楚。合作豬適應(yīng)能力強(qiáng),可望培育出國(guó)內(nèi)外獨(dú)特的高原型小型豬新品系。目前培育成功的貴州小型豬、版納小型豬、巴馬小型豬和五指山小型豬，其均來源于生長(zhǎng)在海拔較低, 溫度、濕度較高的地區(qū)，而合作豬則生長(zhǎng)在截然不同的自然環(huán)境，這是長(zhǎng)期自然選擇的結(jié)果，其適應(yīng)性強(qiáng)可能有其必然性。然而，合作豬繁殖性能低，野性大，毛色雜，不利于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化培育。
合作豬體型小、品種純、適應(yīng)能力強(qiáng)，若能將其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化和小型化定向培育,使之保持體型小、抗病性強(qiáng)，而同時(shí)具有其它品種的優(yōu)良的繁殖性能, 并符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)的需要,即遺傳的均一性、實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和微生物的控制性等,可望培育成國(guó)際上更為理想的實(shí)驗(yàn)用小型豬品系，滿足生命科學(xué)研究、生產(chǎn)及其產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)，具有廣闊的應(yīng)用前景和優(yōu)勢(shì)[2,3,4]。
二、合作小型豬的培育與遺傳穩(wěn)定性分析
2003年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所從夏河縣等地引進(jìn)2頭3-4月齡的一公一母仔豬（兄妹）和一母豬帶仔5頭（母豬約1-2歲，為全黑色；仔豬約20日齡左右，1頭為松鼠背，其余4頭為黑色或六端白），在蘭州進(jìn)行異地適應(yīng)性飼養(yǎng)和觀察。按照“合作豬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化培育、近交系培育和SPF化培育”的三階段總體設(shè)想和戰(zhàn)略布局，在甘肅省科技計(jì)劃項(xiàng)目的支持下，蘭州獸醫(yī)研究所先后開展了“中國(guó)合作小型豬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化培育及分子遺傳特性研究”（1004TCYA001）和“近交系合作小型豬的培育及其分子遺傳特性研究”（1207TCYA025），重點(diǎn)對(duì)其生活習(xí)性、生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖性能和抗病性進(jìn)行觀察，同時(shí)采用現(xiàn)代分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和分子免疫學(xué)技術(shù)對(duì)控制其生長(zhǎng)發(fā)育和抗病相關(guān)的關(guān)鍵分子進(jìn)行分子遺傳特征研究，并對(duì)培育的合作小型豬進(jìn)行免疫學(xué)基礎(chǔ)研究應(yīng)用。
（一）合作小型豬的培育
1.合作豬的馴化與適應(yīng)性培育
在原產(chǎn)地甘南藏族自治州夏河縣引進(jìn)合作豬的基礎(chǔ)上，依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)質(zhì)量控制要求，按照合作豬馴化、飼養(yǎng)和日常管理規(guī)范（草案），在異地環(huán)境（海拔1500m,溫度15～28℃）蘭州市進(jìn)行適應(yīng)性舍飼飼養(yǎng)，每天2次配合飼料自由采食，全天自由飲水，追蹤性觀察和測(cè)定其生活習(xí)性、采食飲水、外貌特征、生長(zhǎng)發(fā)育、生產(chǎn)性能以及生理生化指標(biāo)變化。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，合作豬在飼養(yǎng)和培育到F6～7代時(shí)其野性逐漸消失，吻突變短，絨毛減少，體型鈍圓，毛色光亮，未出現(xiàn)因營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境優(yōu)越而產(chǎn)生體重、體型明顯增大的現(xiàn)象（未發(fā)表資料）。
2.近交系合作小型豬的培育
按照近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳控制標(biāo)準(zhǔn)（甘肅省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局2018-T-106立項(xiàng)制定），采用“兄妹”或“父女”交配的方式進(jìn)行繁殖，追蹤觀察和測(cè)定其外貌特征、生長(zhǎng)發(fā)育、生產(chǎn)性能以及繁殖性能指標(biāo)。經(jīng)封閉近交定向培育，已近交培育到F13～14代，其遺傳性狀日趨穩(wěn)定，初步建立了全黑、六端白、松鼠背和大黑白花合作小型豬4個(gè)近交家系的種群繁殖單元，總種群達(dá)50頭以上。同時(shí)，已制定并經(jīng)甘肅省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布實(shí)施了“實(shí)驗(yàn)用合作小型豬繁育技術(shù)規(guī)程”（DB62/T 2897-2018）地方標(biāo)準(zhǔn)1項(xiàng)，以指導(dǎo)近交系合作小型豬的擴(kuò)群繁殖與生產(chǎn)[5]。
3.封閉群合作小型豬培育
在建立近交系合作小型豬種群繁殖單元的基礎(chǔ)上，按照封閉群遺傳標(biāo)準(zhǔn)和要求，重點(diǎn)建立全黑、六端白、松鼠背3個(gè)封閉群?jiǎn)卧鳛榉敝硵U(kuò)大群，種群達(dá)60頭左右，生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)用合作小型豬800余頭，用于生長(zhǎng)發(fā)育分子遺傳特性、免疫抗病特性以及疫苗質(zhì)量評(píng)價(jià)研究應(yīng)用，探討作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的可行性。試驗(yàn)應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，培育和生產(chǎn)的合作小型豬與商品豬相比具有遺傳背景和微生物攜帶情況清楚、基因純等特點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果均一、重復(fù)性好，適合作為感染、免疫機(jī)制以及疫苗質(zhì)量評(píng)價(jià)的靶動(dòng)物模型（未發(fā)表資料）。
由于目前豬病復(fù)雜多樣，為了防止合作小型豬被自然感染以及培育SPF或非免疫近交系小型豬的需要，按照合作小型豬的遺傳和微生物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)（甘肅省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局2018-T-106和2018-T-107立項(xiàng)制定），在蘭州和靜寧兩地同時(shí)進(jìn)行保種、培育和擴(kuò)大生產(chǎn)，且通常情況下不接種任何疫苗，這為后期SPF級(jí)小型豬的培育奠定了基礎(chǔ)。
（二）合作小型豬生長(zhǎng)發(fā)育遺傳穩(wěn)定性分析
為探討遺傳、營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境對(duì)合作小型豬生長(zhǎng)發(fā)育控制的影響，重點(diǎn)分析其染色體核型以及生長(zhǎng)激素基因的分子組成結(jié)構(gòu)和多態(tài)性，已證實(shí)合作小型豬遺傳多態(tài)性豐富、生長(zhǎng)發(fā)育遺傳穩(wěn)定、體型小的特性，主要由遺傳基因控制而非營(yíng)養(yǎng)、氣候環(huán)境因素決定。
1.染色體核型分析
隨機(jī)無菌采集近交系合作小型豬（公、母各半）抗凝血，37℃恒溫培養(yǎng)68-72h，在終止培養(yǎng)前2-3h加入秋水仙素溶液使細(xì)胞分裂停止在中期，在顯微鏡下觀察細(xì)胞染色體的形狀、數(shù)目和核型。證實(shí)合作小型豬體細(xì)胞染色體為2n=38（母豬為XX，公豬為XY，性染色體以X、Y表示），其中常染色體18對(duì)，性染色體1對(duì)，以其他豬種相同（未發(fā)表資料）。根據(jù)染色體的相對(duì)長(zhǎng)度、著絲點(diǎn)指數(shù)和臂比，將18對(duì)常染色體分為A、B、C、D 四個(gè)形態(tài)組，分別標(biāo)以1～18號(hào)組成合作小型豬的染色體核型。其中A組：由1～5號(hào)5對(duì)染色體組成, 屬于近中著絲點(diǎn)染色體（sm）。B組：由6～7號(hào)2對(duì)染色體組成，屬于近端著絲點(diǎn)染色體(st)。C組：由8～12號(hào)5對(duì)染色體組成，屬于中著絲點(diǎn)染色體(m)。D組：由13～18號(hào)6對(duì)染色體組成，屬于末端著絲點(diǎn)染色體(t)。性染色體：X染色體和Y染色體均屬中著絲點(diǎn)染色體，X染色體的大小介于8號(hào)和9號(hào)染色體之間，Y染色體為最小的中著絲點(diǎn)染色體，較易辨別。
2.生長(zhǎng)發(fā)育控制關(guān)鍵分子遺傳特征研究
生長(zhǎng)激素是控制動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵分子，故以其生長(zhǎng)激素基因?yàn)閷?duì)象，在基因組和轉(zhuǎn)錄水平探討其分子結(jié)構(gòu)、多態(tài)性以及遺傳特征。
（1）合作小型豬生長(zhǎng)激素功能基因與基因組結(jié)構(gòu)分析
從合作小型豬血液中提取基因組DNA，用生長(zhǎng)激素基因參考序列設(shè)計(jì)引物，可擴(kuò)增出1671bp的合作小型豬生長(zhǎng)激素基因組序列。該基因組全長(zhǎng)序列包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，其中外顯子1、2、3、4和5的堿基數(shù)依次是10、161、117、162和201 bp，內(nèi)含子1、2、3和4的堿基數(shù)分別是244、210、192和277 bp，外顯子和內(nèi)含子之間的剪切序列符合GT-AG規(guī)則；合作小型豬生長(zhǎng)激素功能基因全長(zhǎng)651bp，推測(cè)編碼216個(gè)氨基酸的前體蛋白，成熟蛋白是一個(gè)由190個(gè)氨基酸殘基組成的分泌性蛋白。與參考序列比對(duì)，外顯子中取代和缺失的堿基數(shù)合計(jì)為4bp，內(nèi)含子中取代和缺失的堿基數(shù)合計(jì)為15bp，這說明內(nèi)含子的序列多態(tài)性大于外顯子[6,7]。
（2）合作小型豬生長(zhǎng)激素基因序列多態(tài)性分析
為探討合作小型豬的遺傳多態(tài)性，選擇GenBank中14條豬生長(zhǎng)激素基因序列作為參考序列，與合作小型豬的5條生長(zhǎng)激素基因序列比較，其多態(tài)性主要表現(xiàn)在內(nèi)含子1有1個(gè)轉(zhuǎn)換和1個(gè)顛換，內(nèi)含子2有2個(gè)轉(zhuǎn)換，說明合作小型豬間的差異可能與其內(nèi)含子的關(guān)系更密切。合作小型豬與其他14 種豬之間在編碼區(qū)和非編碼區(qū)共檢測(cè)到核苷酸變異155個(gè)，其中內(nèi)含子中有119個(gè)，外顯子中有28個(gè)。在所有的核苷酸變異中，其中顛換有104個(gè)，轉(zhuǎn)換有14個(gè)，缺失有23個(gè)，插入有14個(gè)。在出現(xiàn)的堿基取代位點(diǎn)中，大多數(shù)是顛換型突變，顛換與轉(zhuǎn)換之比為7.43∶1，存在顛換偏移現(xiàn)象。對(duì)合作小型豬生長(zhǎng)激素基因同源性和趨異性分析發(fā)現(xiàn)，合作小型豬與國(guó)內(nèi)其它小型豬同源性較近，與大型豬同源性較遠(yuǎn)。15種豬生長(zhǎng)激素基因遺傳演化分析表明，合作小型豬與Vize 豬有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，與貴州榕江香豬親緣關(guān)系最近[8,9]。
（3）合作小型豬與其它豬種群間的遺傳演化關(guān)系分析
用9個(gè)微衛(wèi)星DNA座位對(duì)5個(gè)豬群體（合作小型豬以及蘭州、武威、臨洮和青海四個(gè)雜種豬群）的125個(gè)個(gè)體的平均等位基因頻率、遺傳距離DA、標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離Ds，主成分PC1、PC2、PC3值進(jìn)行遺傳檢測(cè)。結(jié)果5個(gè)豬群體共檢測(cè)到148個(gè)等位基因，每個(gè)群體等位基因數(shù)的范圍在55～100個(gè)之間，其中青海豬群中最多為100個(gè)，合作小型豬群體中最少為55個(gè)，說明青海豬群體的多態(tài)性高，而合作小型豬群多態(tài)性小。其次，合作小型豬群體與蘭州白雜豬群體不但遺傳距離值最大(DA=0.6781)，而且標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離DS值仍最大，達(dá)到1.3312。主成分分析顯示，PC1、PC2和PC3分別占比為62.17%、16.89%和10.94%，其中第一主成分PC1與合作小型豬有較大的正相關(guān)，與其它的呈較大的負(fù)相關(guān)，它能代表合作小型豬； 第二主成分PC2與蘭州白雜豬有較大的正相關(guān)，與其它的呈負(fù)相關(guān)，它能代表蘭州白雜豬群體；臨洮、青海和武威等三個(gè)雜種豬群體在PC1-PC2坐標(biāo)中具有較近的距離，表明臨洮、青海和武威這三個(gè)雜種豬群體有相似的主成分。這說明合作小型豬群體在遺傳上遠(yuǎn)離蘭州白雜豬群體，更遠(yuǎn)于臨洮、青海和武威三個(gè)雜種豬群體[8,9]。
三、合作小型豬在抗病免疫分子遺傳特征研究中的應(yīng)用
機(jī)體對(duì)病原微生物感染的防御是由天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的，其中天然免疫在機(jī)體的非特異性抗感染免疫過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是機(jī)體抵御病原感染的第一道防線。獲得性免疫由T細(xì)胞和B細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)病原成分而啟動(dòng)的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，發(fā)揮著命運(yùn)決定者的作用。利用已培育的合作小型豬對(duì)其抗病免疫關(guān)鍵分子：主要組織相容性復(fù)合物（MHC）（或豬白細(xì)胞抗原SLAⅠ類和Ⅱ類分子）、T細(xì)胞抗原受體（TCRs）以及模式識(shí)別受體（PRRs）和細(xì)胞因子家族分子基因進(jìn)行系統(tǒng)研究，探討其基因結(jié)構(gòu)組成、多樣性與抗病分子遺傳特征，為免疫抗病基礎(chǔ)研究提供理想的動(dòng)物模型。
（一）合作小型豬天然免疫效應(yīng)分子-細(xì)胞因子研究
機(jī)體免疫系統(tǒng)的應(yīng)答程度決定了其能否阻擋病原的感染，并阻礙感染的進(jìn)一步發(fā)展，而其效應(yīng)機(jī)制主要是通過高活性多功能的小分子多肽、蛋白質(zhì)或糖蛋白等細(xì)胞因子來實(shí)現(xiàn)，大多數(shù)的細(xì)胞因子以旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌的形式發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。目前按其主要生物學(xué)功能分為白介素(IL)、干擾素（IFN）、集落刺激因子(CSF)等六大類。合作豬是適應(yīng)性和抗逆性較強(qiáng)的豬種，由于細(xì)胞因子是免疫抗病的主要效應(yīng)分子，因此從其抗病免疫相關(guān)的細(xì)胞因子研究入手探討合作小型豬與抗病的關(guān)系。
首先，建立了刺激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴(kuò)增法和cDNA表達(dá)文庫(kù)法克隆、發(fā)現(xiàn)抗病免疫相關(guān)細(xì)胞因子基因的技術(shù)，為高通量篩選和發(fā)現(xiàn)未知細(xì)胞因子或其它相關(guān)分子奠定了基礎(chǔ)[10]。其次，以合作小型豬為研究對(duì)象，采用誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴(kuò)增法和cDNA基因文庫(kù)法技術(shù)，先后克隆、表達(dá)和鑒定分析了豬白介素家族的IL-2、4、6、12、18基因[11-17]，豬干擾素家族的IFN-α/γ基因[18,19]，集落刺激因子基因[20]，CD58基因[21]以及CD4/CD8分子基因[22-24]等；建立了動(dòng)物體內(nèi)重組表達(dá)含細(xì)胞因子基因或組合的重組質(zhì)粒免疫佐劑[25-26]，先后申報(bào)專利5項(xiàng)，授權(quán)3項(xiàng)，結(jié)合其他相關(guān)研究成果獲得數(shù)項(xiàng)省部級(jí)科技獎(jiǎng)勵(lì)。
（二）合作小型豬天然免疫識(shí)別分子-PPRs研究
由于模式識(shí)別受體是近20年來才發(fā)現(xiàn)和定義的與機(jī)體天然免疫最重要的、最直接的相關(guān)分子，目前已先后發(fā)現(xiàn)了TOLL樣受體（TLRs）、RIG-I樣受體（RLRs）、NOD樣受體（NLRs）、AIM2樣受體（ALRs）、C型凝集素受體（CLRs）、胞質(zhì)DNA識(shí)別受體家族如cGAS（cGAMP synthase）等，其中TLRs是在小鼠和人類上最早發(fā)現(xiàn)并研究得比較深入的家族，故在合作小型豬模式識(shí)別受體研究中以其為重點(diǎn)，探討其與抗病的相關(guān)性。
首先，建立了用基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法克隆、鑒定TLRs家族基因的技術(shù)，成功先后克隆、表達(dá)和分析了豬TLR2[27,28]、TLR3[29]、TLR7/TLR8[30,31]以及接頭分子MyD88基因[33]等，明確了其分子遺傳演化關(guān)系，揭示了其與天然免疫的關(guān)系；同時(shí)克隆、表達(dá)和分析了豬cGAS、RIG-I、DHX15、DHX16等受體的分子結(jié)構(gòu)特征與模式識(shí)別抗病毒作用（未發(fā)表資料），為模式識(shí)別天然免疫分子機(jī)制研究以及免疫佐劑、抗病毒藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
（三）合作小型豬獲得性免疫相關(guān)分子-MHC研究
動(dòng)物機(jī)體識(shí)別自我、排除非己成分以維持其正常生理活動(dòng)和抵抗疾病的能力，與其主要組織相容性復(fù)合體( MHC)密切相關(guān)，其不僅控制著機(jī)體移植排斥反應(yīng)，還參與機(jī)體對(duì)內(nèi)/外源性抗原的識(shí)別、結(jié)合，與機(jī)體獲得性免疫應(yīng)答有關(guān)。MHC分子在人類稱為HLA，在豬稱為SLA (Swine lymphocyte antigen)。其中經(jīng)典的SLAⅠ類和SLAⅡ類是其免疫相關(guān)的最重要的分子家族[34]。以合作小型豬為研究對(duì)象，并與甘肅白豬和相關(guān)物種的SLA基因作比較，重點(diǎn)研究其SLAⅠ類和Ⅱ類分子的基因結(jié)構(gòu)及其遺傳多態(tài)性，為抗病基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。
在國(guó)內(nèi)首次系統(tǒng)克隆和分析了豬MHCⅠ類/Ⅱ類分子中的SLA-1、SLA-2、SLA-3以及DRA/DRB、DQA/DQB的基因組13個(gè)（SLAⅠ類分子GenBank登錄號(hào)為FJ905829～FJ905834，SLAⅡ類分子為FJ905835～FJ905840）和功能基因14個(gè)（SLAⅠ類分子GenBank登錄號(hào)為FJ905817～FJ905822，SLAⅡ類分子為FJ905823～FJ905828），證實(shí)合作小型豬SLAⅠ類分子的基因組均由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成；而SLAⅡ類分子α、β鏈的外顯子和內(nèi)含子組成有差異，其中DRA和DQA由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，DQB由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，DRB則由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，明確了合作小型豬SLAⅠ類和Ⅱ類分子基因組的組成結(jié)構(gòu)[35,36]。
系統(tǒng)分析合作豬SLAⅠ類基因結(jié)構(gòu)的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)SLAⅠ類分子基因可分為五個(gè)功能區(qū)，其多態(tài)性位點(diǎn)主要集中在α1與α2結(jié)構(gòu)域，具有較多的單態(tài)性核苷酸位點(diǎn)（SNPs），其中核苷酸非同義置換位點(diǎn)數(shù)多于同義置換位點(diǎn)數(shù)。SLAⅠ類分子共有21個(gè)新的SNPs位點(diǎn)，其中SLA-1有4個(gè)，主要位于α2和α3功能區(qū)；SLA-2有6個(gè)，主要位于α1、α2和α3功能區(qū)；SLA-3有13個(gè)，主要位于α2和α3功能區(qū)。系統(tǒng)分析合作豬SLAⅡ類基因的結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)SLAⅡ類分子基因在四個(gè)功能區(qū)的多態(tài)性位點(diǎn)主要集中在α1（β1）結(jié)構(gòu)域。SLAⅡ類分子共有23個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中DRA有5個(gè)，DQA有6個(gè)；DQB有4個(gè)，DRB有7個(gè)。這基本明確了合作小型豬SLAⅠ類和Ⅱ類分子功能基因的多態(tài)性和遺傳特征，并針對(duì)這些遺傳特點(diǎn)重點(diǎn)分析了合作小型豬SLAⅠ類和Ⅱ類分子與抗原多肽、TCR、CD4/CD8結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)與特征，揭示了合作小型豬SLA分子與抗原多肽、TCR以及CD4/CD8多分子識(shí)別結(jié)合的特異性和復(fù)雜性[37]。
揭示了豬瘟C株疫苗免疫誘導(dǎo)PBMC的SLA等位基因優(yōu)勢(shì)選用，可能與T細(xì)胞的克隆化存在一定的相關(guān)性[38]。在豬瘟C株疫苗免疫后，實(shí)驗(yàn)豬均表現(xiàn)出規(guī)律性的差異表達(dá)趨勢(shì)。其中實(shí)驗(yàn)豬的SLAⅡ類基因（SLA-DQA、SLA-DQB、SLA-DRA和SLA-DRB）在第3天和第5天均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，其中第5天達(dá)到高峰約為免疫前的2-2.5倍，第9天開始回落；SLAⅠ類基因在第3天表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量約為免疫前1.5-2倍，第5天均回落；分別用SLA-DQA、SLA-DQB、SLA-DRA和SLA-DRB的特異性引物PCR 擴(kuò)增其全長(zhǎng)基因發(fā)現(xiàn)，基因擴(kuò)增條帶單一，與目標(biāo)片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。但進(jìn)一步測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)免疫豬SLA-DRA和SLA-DRB中均存在一個(gè)高頻表達(dá)的全長(zhǎng)序列（等位基因亞型），說明豬瘟疫苗毒免疫后能促進(jìn)機(jī)體SLA的表達(dá)，并產(chǎn)生抗豬瘟病毒免疫特異的反應(yīng)，且與機(jī)體抗原遞呈細(xì)胞（APC）經(jīng)受抗原刺激而活化參與T細(xì)胞免疫應(yīng)答的規(guī)律相類似，這為豬瘟新型表位肽疫苗研制提供了理論依據(jù)。
（四）合作小型豬獲得性免疫相關(guān)分子-TCR研究
T細(xì)胞受體（αβTCR）在機(jī)體獲得性細(xì)胞免疫中扮演著重要角色，但由于其基因的遺傳多樣性和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，基于病毒感染或免疫特異的豬αβT細(xì)胞克隆化增殖研究在國(guó)際上尚屬空白[39,40]。
以合作小型豬為研究對(duì)象，開展了豬TCR分子基因結(jié)構(gòu)與復(fù)雜性研究, 系統(tǒng)克隆和分析了TCRα基因108個(gè)[41]、TCRβ基因98個(gè)[42]、TCRγ基因15個(gè)和TCRδ鏈基因5個(gè)，共計(jì)226個(gè)功能分子基因，初步建立了“健康”豬αβTCR和γδTCR T細(xì)胞TCR基因庫(kù)。測(cè)序分析表明，豬α、β、γ、δ 4種TCR亞基鏈都含有信號(hào)肽區(qū)、V區(qū)、D/J區(qū)和C區(qū)基因片段，但其亞基鏈間以及同一亞基其基因序列組成都有所不同，這驗(yàn)證了T細(xì)胞激活后能產(chǎn)生胚系發(fā)育和基因重排現(xiàn)象，證實(shí)了TCR基因的胚系發(fā)育、基因重排規(guī)律與其分子結(jié)構(gòu)多樣性的相關(guān)性。
成功建立了豬CD8+、CD4+的T細(xì)胞亞群TCR CDR3區(qū)基因譜型分析技術(shù)，研究了臨床健康豬TCRα、β鏈CDR3的譜型種類及多樣性。發(fā)現(xiàn)20個(gè)TRAV家族和TRBV家族在大部分αβTCR家族中表達(dá)，且其CDR3的譜型呈現(xiàn)類高斯分布，大多數(shù)含有8種以上不同長(zhǎng)度的CDR3片段；同時(shí)，同一個(gè)體中不同TRV家族CDR3的出現(xiàn)頻次相差較大，即使同一TRV家族在不同個(gè)體中的出現(xiàn)頻次也不完全相同。這些現(xiàn)象和規(guī)律與αβT細(xì)胞胚系發(fā)育、基因重排的分子機(jī)制和多樣性特征相一致[43,44]。
首次分析了豬瘟C株疫苗毒感染特異的T細(xì)胞αβTCR表達(dá)規(guī)律及其結(jié)構(gòu)特征，明確了免疫后豬CD4+和CD8+ T 細(xì)胞TCRα鏈和β鏈多樣性與克隆化動(dòng)態(tài)規(guī)律，搞清了二次免疫后呈現(xiàn)克隆性擴(kuò)增的TRAV和TRBV家族CDR3序列結(jié)構(gòu)特征，為豬瘟病毒抗原肽疫苗研制和病原抗原免疫機(jī)制研究提供了依據(jù)[45]。
對(duì)克隆化的αβTCR 家族CDR3區(qū)及全長(zhǎng)基因測(cè)序和分析發(fā)現(xiàn)，αβTCR 家族CDR3區(qū)除有經(jīng)典的分子結(jié)構(gòu)特征外，其中TRBV CDR3區(qū)還有保守的 P-A-V氨基酸基序，TRAV CDR3區(qū)也存在保守的D-D-Y氨基酸基序,而且CDR區(qū)序列完全相同的基因表達(dá)頻率較高，可達(dá)50％以上。其次，克隆化αβTCR 完全相同CDR3區(qū)的全長(zhǎng)基因成員間的核苷酸序列相似度均在99%以上，這說明這些克隆化家族CDR3區(qū)的保守氨基酸基序可能與豬瘟病毒特異抗原肽的識(shí)別和結(jié)合有關(guān)，這為高通量篩選和開發(fā)豬瘟多肽疫苗提供了理論和技術(shù)依據(jù)[46]。
四、結(jié)論
成功異地近交培育了合作小型豬4個(gè)近交家系和3個(gè)封閉群，證實(shí)其體型小的特性，主要由遺傳基因控制而非營(yíng)養(yǎng)、氣候環(huán)境因素決定。證實(shí)了合作小型豬群體內(nèi)等位基因數(shù)目少、重復(fù)次數(shù)高和遺傳穩(wěn)定，與其它豬群體間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)，且沒有杜洛克等西方豬血緣，是一群比較理想的獨(dú)特的高原型近交群體。合作小型豬抗病免疫關(guān)鍵分子基因分析發(fā)現(xiàn)，其具有豐富的多態(tài)性和多樣性，一方面說明合作豬具有長(zhǎng)期適應(yīng)各種惡劣的自然環(huán)境和復(fù)雜的病原微生物環(huán)境的抗病遺傳能力，另一方面說明合作小型豬的這種遺傳特性適合用于研究復(fù)雜的免疫學(xué)現(xiàn)象與機(jī)制。
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