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美鳳力臨床前大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心
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在基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，外顯子和內(nèi)含子都會(huì)被復(fù)制到前體信使RNA（pre-mRNA）中，隨后通過(guò)剪接去除內(nèi)含子，獲得編碼序列，最終翻譯成蛋白質(zhì)。隨著全基因組測(cè)序的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到內(nèi)含子突變?cè)诙喾N疾病，尤其是罕見病中，具有重要作用。研究表明，約10%-30%的疾病相關(guān)基因突變（主要為內(nèi)含子突變）會(huì)影響剪接或通過(guò)調(diào)控元件（如增強(qiáng)子和沉默子）的失調(diào)，引發(fā)隱性剪接位點(diǎn)激活、假外顯子包含和外顯子跳躍等機(jī)制，最終導(dǎo)致疾病。這些機(jī)制通常會(huì)產(chǎn)生提前終止密碼子（PTC），引發(fā)無(wú)義介導(dǎo)的RNA降解（NMD）、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變或基因/蛋白表達(dá)水平失調(diào)[1-3]。今天為大家介紹的家族性自主神經(jīng)功能障礙研究模型，即是由內(nèi)含子突變引發(fā)的典型疾病案例。
圖1 內(nèi)含子突變對(duì)Pre-mRNA剪接的常見影響類型[3] 
家族性自主神經(jīng)功能障礙（FD）與ELP基因內(nèi)含子突變 家族性自主神經(jīng)功能障礙（FD）是一種罕見的遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，由神經(jīng)元發(fā)育受損和中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化引起?；颊咭蜃灾魃窠?jīng)系統(tǒng)和感覺神經(jīng)系統(tǒng)的缺陷，表現(xiàn)出多汗、間歇性高血壓、流涎、吞咽困難、大小便失常、呼吸困難及周期性嘔吐等癥狀。該病具有種族特異性，主要影響德系猶太人，在該人群中的發(fā)病率約為1/3600，僅約50%的患者能存活至40歲[4-5]。ELP1（IKBKAP）基因編碼延伸復(fù)合物組成部分，在神經(jīng)元的發(fā)育和功能中發(fā)揮重要作用。幾乎所有FD患者都攜帶ELP1基因雙拷貝突變，其中超過(guò)99%為第20號(hào)內(nèi)含子5'剪接位點(diǎn)突變（IVS20+6T>C）。該突變破壞了U1小核核糖核蛋白與第20號(hào)內(nèi)含子供體剪接位點(diǎn)的堿基配對(duì)，導(dǎo)致第20號(hào)外顯子跳躍[4-6]。這種錯(cuò)誤剪接導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本框架移位，產(chǎn)生提前終止密碼子（PTC），從而翻譯出截短的ELP蛋白，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和死亡。 圖2 ELP1/IKBKAP內(nèi)含子突變IVS20+6T>C導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本剪接異常的機(jī)制[6] 
靶向ELP1的FD療法及相關(guān)動(dòng)物模型 目前，F(xiàn)D尚無(wú)根治方法，治療策略主要集中在對(duì)癥治療和支持性護(hù)理，以緩解癥狀并預(yù)防并發(fā)癥。由于IVS20+6T>C突變是FD最常見的致病突變，研究的重點(diǎn)在于糾正該突變引起的錯(cuò)誤剪接模式，以生成全長(zhǎng)ELP1蛋白。冷泉港實(shí)驗(yàn)室和PTC Therapeutics的研究人員在這一領(lǐng)域開展了諸多研究，包括反義寡核苷酸（ASO）和小分子藥物的開發(fā)[7-9]。研究表明，使用野生型小鼠研究?jī)?nèi)含子突變ELP1基因的剪接模式不可行，而純合Elp1基因敲除小鼠會(huì)在胚胎期死亡。表達(dá)帶有人源突變ELP1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠由于正常水平的內(nèi)源性小鼠Elp1基因表達(dá)，未表現(xiàn)出明顯的疾病表型，因此需要結(jié)合小鼠內(nèi)源性Elp1基因單拷貝敲除，但這仍存在轉(zhuǎn)基因拷貝不穩(wěn)定和表型不一致等問(wèn)題[10-12]。此外，由于小鼠和人類基因剪接模式的差異，將小鼠Elp1基因第20號(hào)外顯子及其兩側(cè)內(nèi)含子人源化并引入IVS20+6T>C突變，同樣未能產(chǎn)生表型[13]。 圖3 通過(guò)小分子藥物調(diào)控IKBKAP IVS20+6T>C第20號(hào)外顯子剪接模式[9] 以上研究表明，在小鼠體內(nèi)研究ELP1基因剪接模式可能需要更長(zhǎng)甚至全長(zhǎng)人類ELP1基因序列。針對(duì)這一需求，賽業(yè)生物研發(fā)了小鼠Elp1基因人源化的B6-hELP1模型（產(chǎn)品編號(hào)：I001203），其中小鼠Elp1基因從起始密碼子到終止密碼子的序列被原位替換為人源ELP1基因的對(duì)應(yīng)序列。此外，在此基礎(chǔ)上還構(gòu)建了IVS20+6T>C人源化疾病模型，以滿足廣大科研人員在FD研究中的需求。 
B6-hELP1小鼠成功表達(dá)人源ELP1基因 檢測(cè)結(jié)果表明，在B6-hELP1小鼠的大腦皮層、腎臟、肝臟、骨骼肌和心臟中均存在人源ELP1基因的顯著表達(dá)，且不存在鼠源Elp1基因的表達(dá)。 圖4 B6-hELP1小鼠和野生型小鼠體內(nèi)人源ELP1基因和鼠源Elp1基因的表達(dá) 總 結(jié) 目前FD治療研究主要集中在糾正突變引起的錯(cuò)誤剪接模式，以生成全長(zhǎng)ELP1蛋白。B6-hELP1模型（產(chǎn)品編號(hào)：I001203）在小鼠體內(nèi)表達(dá)全長(zhǎng)的人源ELP1基因，并且不存在小鼠內(nèi)源性Elp1基因的干擾，可用于FD研究。根據(jù)前期研究，基于B6-hELP1小鼠構(gòu)建的B6-hELP1 IVS20+6T>C人源化點(diǎn)突變模型（在研）預(yù)計(jì)將出現(xiàn)與人類FD相似的表型。 此外，賽業(yè)生物在神經(jīng)、眼科等疾病研究領(lǐng)域開發(fā)了多種遺傳疾病模型和人源化模型，為研究人員開發(fā)針對(duì)不同疾病的靶向藥物提供了有力支持。 HUGO-GT?全基因組人源化模型
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