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美鳳力臨床前大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心
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摘要：人參皂苷Rg3是人參中主要的甾體皂苷之一，具有多種治療作用。在本研究中，我們通過分析熒光強(qiáng)度、總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平，研究了人參皂甙Rg3對(duì)高脂飲食（HFD）斑馬魚仔魚模型中脂質(zhì)積累的影響。還根據(jù)體長、體重、體重指數(shù) (BMI)、蘇木精-伊紅 (HE) 染色、油紅染色、定量 PCR、TC 和 TG 評(píng)估人參皂甙 Rg3 在 HFD 成年斑馬魚模型中的作用。此外，還測(cè)定了斑馬魚中能夠?qū)⑷藚⒃碥誖g3代謝為人參皂苷去糖基化酶人參皂苷Rh2和人參皂苷去糖基化原人參二醇的腸道細(xì)菌。結(jié)果表明，與高膽固醇（HC）組相比，人參皂甙Rg3給予的HFD斑馬魚仔魚模型的局部軀干熒光密度降低。此外，Rg3 治療組的 TC 水平顯著低于 HC 組。然而，兩組之間的TG水平?jīng)]有顯著差異。此外，Rg3可以改善HFD引起的相關(guān)影響，并使斑馬魚的體長、體重和BMI接近正常水平。肝臟HE和油紅O染色顯示肝細(xì)胞有明顯的脂滴聚集和組織病理學(xué)變化。Rg3治療可減輕這些變化。Rg3誘導(dǎo)脂質(zhì)分解代謝相關(guān)和合成代謝相關(guān)基因的表達(dá)，其機(jī)制可能與膽固醇合成的下調(diào)和膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的上調(diào)有關(guān)。這些結(jié)果反映了Rg3對(duì)脂質(zhì)代謝的影響，表明人參皂甙Rg3可以減少脂肪積累，可能是預(yù)防肥胖的潛在藥物。
關(guān)鍵詞：人參皂甙Rg3 脂肪堆積 肥胖 斑馬魚
簡介：人參皂苷Rg3是人參中重要的功能活性成分，本研究證實(shí)了其減肥作用。這項(xiàng)研究表明，Rg3可以被視為潛在的抗肥胖藥物的候選治療藥物。這項(xiàng)工作將進(jìn)一步促進(jìn)人參及其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用。肥胖是一種醫(yī)學(xué)疾病，體內(nèi)多余的脂肪積累到可能對(duì)健康產(chǎn)生負(fù)面影響的程度，會(huì)增加患各種疾病的風(fēng)險(xiǎn)。大多數(shù)肥胖病例是食源性肥胖，例如由高熱量食物或高脂肪和糖攝入引起的肥胖。 食源性肥胖易導(dǎo)致腹腔內(nèi)脂肪組織堆積，形成脂肪肝。近年來，人們做出了許多努力來尋找和應(yīng)用替代方法來減少肥胖的影響。對(duì)可能影響與肥胖、心血管疾病和糖尿病相關(guān)的生物體特定分子途徑的天然生物活性化合物進(jìn)行了研究。紅參富含人參皂甙Rg3，一種原人參二醇皂苷成分。 該成分的藥用特性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、抗糖尿病和抗癌作用已得到證實(shí)。人參皂苷 Rg3 在人參根提取物和漿果中的天然含量非常低，但可以通過傳統(tǒng)方法在紅參和黑參中增加，并通過酸或熱處理或生物轉(zhuǎn)化從甙元人參皂苷去糖基化酶原人參二醇 (PPD) 轉(zhuǎn)化而來。研究表明，人參皂甙 Rg3 可減少附睪白色脂肪組織的大小、 降低肝脂肪變性、降低小鼠模型附睪白色脂肪組織和肝臟中的 TG 水平。Rg3 還降低肥胖小鼠肝臟 PPAR-γ、C/EBP-α 蛋白、肝臟谷胱甘肽還原酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平。這些結(jié)果表明人參皂甙 Rg3 可能是一種潛在的抗肥胖劑。 Rg3 的抗肥胖作用已在小鼠模型中得到證實(shí)。斑馬魚的能量平衡調(diào)節(jié)與哺乳動(dòng)物相似。斑馬魚是研究代謝疾病的有吸引力的模型系統(tǒng)，因?yàn)樗鼈冊(cè)谥|(zhì)代謝、脂肪生物學(xué)、胰腺結(jié)構(gòu)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)中的功能保守。之前報(bào)道過人參皂甙Rg3降低了高膽固醇飼料飼養(yǎng)的斑馬魚仔魚的熒光水平。然而，人參皂甙Rg3對(duì)斑馬魚脂肪積累的潛在作用及其機(jī)制尚不清楚。在這項(xiàng)研究中，用Rg3給予斑馬魚仔魚和肥胖成年斑馬魚。從實(shí)驗(yàn)研究中，我們發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rg3減少了斑馬魚仔魚的脂肪積累，使斑馬魚的體長和體重接近正常水平。同時(shí)，斑馬魚腸道糞便中人參皂甙Rh2和PPD的存在提示Rg3在消化過程中被腸道微生物轉(zhuǎn)化。脂質(zhì)代謝關(guān)鍵分子的變化為理解人參皂苷Rg3在分子水平上對(duì)脂肪積累的抑制作用提供了關(guān)鍵線索。這項(xiàng)研究表明，Rg3可以作為抗肥胖藥物的候選藥物。
Rg3對(duì)喂飼HFD的斑馬魚仔魚脂質(zhì)積累的影響：如圖2a所示，熒光密度最高的區(qū)域是腹部，主要包含內(nèi)臟和腸道等器官。結(jié)果表明，該部位脂質(zhì)積累最強(qiáng)。斑馬魚在大約5-7 dpf時(shí)開始進(jìn)食。之前它們唯一的能量來源是胚胎卵黃。在發(fā)育的前 4 天，斑馬魚胚胎完全依靠卵黃囊獲取維持其生長和生存所需的營養(yǎng)。當(dāng)卵黃耗盡時(shí)，仔魚必須進(jìn)食以獲得脂質(zhì)。 以每克蛋白質(zhì)含量進(jìn)行組間比較，以消除個(gè)體間生長差異對(duì)測(cè)定的影響，結(jié)果見圖2?？紤]到喂食過程中TC和TG的含量在11 dpf之前沒有顯著變化，因此選擇12 dpf作為喂食日。
圖 1 、HFD 仔魚斑馬魚 TC 和 TG 水平。
圖 2. 給予人參皂苷 Rg3 對(duì)脂肪堆積的影響。
將含有 25、50 和 100 μg g - 1 人參皂甙 Rg3 和 HFD 的日糧給予 5 dpf 至 16 dpf 的不同斑馬魚仔魚組，每天兩次，持續(xù) 1 小時(shí)，以測(cè)試喂食 HFD 的斑馬魚對(duì) Rg3 干預(yù)的反應(yīng)。圖 2a 顯示了斑馬魚仔魚的熒光顯微鏡圖像。 該圖顯示，在飼喂人參皂甙-Rg3-膽固醇日糧后斑馬魚體內(nèi)的膽固醇積累減少。檢測(cè) 5 條斑馬魚仔魚的 TC 和 TG 水平，進(jìn)一步了解 Rg3 給予對(duì)膽固醇積累的影響。結(jié)果顯示，Rg3組TC水平明顯低于HC組。 但各組TG水平與HC組相比無明顯下降。結(jié)果顯示，盡管Rg3治療組的體內(nèi)熒光水平相對(duì)于HFD組有所降低，但兩組之間的差異并不顯著。斑馬魚腸道的末端被認(rèn)為在左邊。 比較不同組的局部干細(xì)胞的熒光密度發(fā)現(xiàn)，與HC組相比，Rg3-25和Rg3-100組局部干細(xì)胞的膽固醇積累顯著降低。膽固醇是動(dòng)物細(xì)胞生物合成的前體，對(duì)激素和膽汁酸很重要。然而，膽固醇過高是發(fā)生心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素，心血管疾病是導(dǎo)致健康狀況不佳和死亡的主要原因。之前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，Rg3抑制3T3L1前脂肪細(xì)胞、棕色脂肪細(xì)胞和人類原代前脂肪細(xì)胞的分化，并減少成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞中的脂滴積累和大小。這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，Rg3 減少了 HFD 斑馬魚仔魚模型中的脂肪積累。
Rg3對(duì)HFD誘導(dǎo)肥胖成年斑馬魚體重、體長和BMI的影響：成年斑馬魚用普通飼料、SD飼料、HFD或含Rg3的飼料（25、50和100μg/g） 飼喂40天，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較。測(cè)量了每組10條斑馬魚的體重和長度。如圖3a-3c所示，隨著攝食時(shí)間的延長，HC組斑馬魚的體長在第10-40天增加不超過5%。從第 10 天到第 20 天，體重顯著增加了 20.9%。從第 20 天到第 50 天，體重增加相對(duì)緩慢。特別是從第 30 天到第 50 天，體重幾乎沒有變化。然而，第40天斑馬魚的體重最高。在第10天和第20天之間觀察到有很大差異，增加了11.67%。與第10天相比，第20天的BMI呈小幅上升趨勢(shì)，第30天后變化可忽略不計(jì)。第40天的BMI最大。 雖然第 50 天的 BMI 較第 40 天下降了 3%，但趨于穩(wěn)定。 一般來說，HFD 對(duì)斑馬魚的體長幾乎沒有影響，但對(duì)體重有相當(dāng)大的影響，從而影響 BMI。
圖 3 、人參皂甙 Rg3 的抗肥胖作用
測(cè)量每組15條斑馬魚標(biāo)本的體重和長度。 與 HFD 處理相比，Rg3 給予導(dǎo)致體長整體增加。Rg3-50 和 Rg3-100 組的體長增加尤為顯著。Rg3-25 組相對(duì)于 HC 組體重減輕顯著，但與其他組無顯著差異。同時(shí)辛伐他汀對(duì)斑馬魚體長的影響比對(duì)體重的影響更顯著。Rg3-25和Rg3-100組的BMI顯著低于HC組，Rg3-50組的BMI接近正常組。這些結(jié)果表明，Rg3可以改善HFD引起的相關(guān)影響，從而使斑馬魚的體長和體重接近正常水平。
Rg3對(duì)HFD誘導(dǎo)肥胖成年斑馬魚TC和TG水平的影響：每10天采集10條斑馬魚血樣測(cè)定TC和TG含量，評(píng)價(jià)HFD持續(xù)時(shí)間對(duì)高脂斑馬魚模型血脂水平的影響。結(jié)果表明， HFD 喂養(yǎng) 40 天后，最高血液 TC 水平達(dá)到 20.58 ± 58 ± 0.4 mmol/L。第20～40天TC水平明顯升高，第30天TC含量為15.76±76±0.17 mmol/L，比第20天增加81.65%。第40天TC含量比第30天高30.55%。與前幾天觀察到的變化相比，從第 40 天到第 50 天的下降程度幾乎可以忽略不計(jì)。HC組斑馬魚的血TG水平在第40天之前穩(wěn)步上升，在第40天達(dá)到最高水平4.41±0.07mmol/L，然后在第40天之后略有下降。第40天的TG水平比第30天高33.40%，第20至30天的TG水平比第30至40天高24.32%。在第30天之后出現(xiàn)了顯著差異。第 40 天后未觀察到顯著差異。 這些結(jié)果表明，高脂肪對(duì)斑馬魚血液中TG水平的影響小于對(duì)TC水平的影響。人參皂苷Rg3組TC、TG水平低于HC組。不同日糧喂養(yǎng)40天后，Rg3-100組血清TC和TG水平分別下降36.49%和29.97%；Rg3-50組分別增加17.93%和25.83%；Rg3-25組中分別增加13.16%和11.90%。以上兩組數(shù)據(jù)的研究表明，人參皂苷Rg3可以降低血液中TC和TG的水平，發(fā)揮一定的降血脂作用。在 HFD 小鼠中，20(R)-Rg3 通過調(diào)節(jié) MAPK 和 NF-κB 信號(hào)通路降低血清 TC、TG、LDL-c 和 HDL-c 的水平。Rg3 降低肝臟和 3T3L1 細(xì)胞中的 TG 水平。 在 Rg3 給予下，仔魚和成年斑馬魚 TC 和 TG 水平的降低與在細(xì)胞和小鼠中觀察到的一致。
圖4、HFD和人參皂甙Rg3對(duì)斑馬魚血脂的影響。
人參皂甙 Rg3 在腸道內(nèi)的轉(zhuǎn)化：喂養(yǎng)40天后從Rg3給予組收集腸道內(nèi)容物，以研究人參皂苷Rg3在腸道吸收前的代謝過程。樣品用水飽和正丁醇提取三次。采用薄層色譜法檢測(cè)人參皂苷Rg3的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果表明，斑馬魚口服Rg3后，Rg3可在胃腸道代謝為人參皂甙去糖基酶人參皂甙Rh2和PPD。人參皂甙和人參皂甙產(chǎn)品是口服的，它們的活性成分不可避免地會(huì)進(jìn)入腸道。在從胃腸道吸收到血液中之前，這些成分可能會(huì)被腸道菌群轉(zhuǎn)化。以往的研究結(jié)果表明，在大鼠糞便菌群代謝過程中，人參皂苷Rg3代謝為Rh2和PPD。20(S)-Rg3比20(R)-Rg3更容易吸收，具體而言，口服吸收后，20(S)-Rg3主要分布于小鼠肝臟和胃腸道，其在肝臟中的濃度高于在血漿中的濃度。需要對(duì)斑馬魚中Rg3的轉(zhuǎn)化和吸收進(jìn)行進(jìn)一步研究。
Rg3 可防止 HFD 引起的肥胖斑馬魚中的脂質(zhì)積累：肝脂肪變性是肥胖引起的病理的重要指標(biāo)。 因此，研究了 Rg3 是否可以減少 HFD 誘導(dǎo)的肥胖成年斑馬魚的肝脂肪變性。用與人參皂苷或辛伐他汀混合的 HFD 喂養(yǎng) 40 天后獲得肝臟樣本，并觀察肝臟的組織病理學(xué)。HC組HE染色顯示肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積明顯， Rg3和辛伐他汀治療組可見少量脂肪泡，肝細(xì)胞排列規(guī)則。通過肝油紅O染色進(jìn)一步證實(shí)了Rg3的高膽固醇血癥作用。 值得注意的是，用 Rg3 治療 HFD 完全抑制了脂肪浸潤。這一結(jié)果證實(shí)了Rg3抑制肝臟脂肪積聚的能力。此外，組織學(xué)HE和紅油O染色數(shù)據(jù)顯示，Rg3給予的斑馬魚的脂質(zhì)成分低于HC組。為了進(jìn)一步評(píng)估 Rg3 對(duì)肝臟脂肪堆積的性能，進(jìn)行了油紅 O 染色的陽性面積比進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，Rg3治療組的陽性面積比例低于HC組，但依賴性沒有降低。 Rg3 的治療改善了肝臟脂質(zhì)積累。肥胖可引起肝臟脂肪變性，這是一個(gè)重要的指標(biāo)。在這項(xiàng)研究中，Rg3給予的HFD斑馬魚模型顯示，與HC組相比，肝脂肪變性減少，脂肪含量降低。
圖5、Rg3引起的肝臟問題
HFD誘導(dǎo)肥胖成年斑馬魚肝臟mRNA的表達(dá)：HMGCR、LDLR、SREBP2、ABCG1、MTP 和 NPC1L1 是脂質(zhì)調(diào)節(jié)中的主要轉(zhuǎn)錄因子。與HC組相比，人參皂苷Rg3顯著降低斑馬魚肝臟中HMGCR mRNA的表達(dá)，Rg3-25、Rg3-50和Rg3-100組HMGCR mRNA表達(dá)水平分別下降0.05、0.03 , 和 0.24 倍。在40天的喂養(yǎng)期內(nèi)，Rg3給予使Rg3-50和Rg3-100組SREBP2的mRNA表達(dá)分別上調(diào)4.26倍和3.62倍。LDLR 是一種參與膽固醇內(nèi)吞作用的細(xì)胞受體。 從圖中可以看出，與喂食HFD的相比，用Rg3給予的LDLR mRNA水平分別降低了0.26、0.03和0.07倍。Rg3誘導(dǎo)Rg3–50和Rg3–100組的MTP表達(dá)。Rg3-50組ABCG1的表達(dá)增加了2.78倍，Rg3-100組增加了4.22倍。 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 NPC1L1 的表達(dá)在 Rg3-50 和 Rg3-100 組中顯著上調(diào)。
圖6、給予人參皂甙Rg3的斑馬魚肝臟的相對(duì)mRNA表達(dá)。
研究表明，SREBP2 的過表達(dá)增加了轉(zhuǎn)基因小鼠中 HMGCR 的 mRNA 水平。 HMGCR調(diào)控的關(guān)鍵控制點(diǎn)是限速酶和他汀類藥物的靶點(diǎn)。SREBP家族包括SREBP1a、SREBP1c和SREBP2，是脂質(zhì)代謝的主要調(diào)節(jié)者。SREBP2特異性調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)。膽固醇的吸收始于NPC1L1。研究表明，肝臟NPC1L1在膽汁中吸收膽固醇的過程中起著關(guān)鍵作用。
結(jié)論：Rg3 是一種從人參中提取的三萜皂苷和主要活性化合物，可為人類提供多種潛在的健康益處。 Rg3可用于治療代謝綜合征。研究了人參皂甙對(duì)脂肪細(xì)胞和小鼠的減肥作用。在本研究中，研究了Rg3對(duì)HFD誘導(dǎo)的斑馬魚肥胖的影響。研究結(jié)果表明，Rg3 減少了喂食 HFD 的斑馬魚仔魚的脂肪積累。HC組的熒光強(qiáng)度增加，而Rg3給予組的熒光強(qiáng)度以劑量依賴性方式顯著降低。Rg3治療增加了體重，但對(duì)體長沒有顯著影響。Rg3給予降低高脂血癥成年斑馬魚的TC和TG水平。HE和油紅O染色顯示，Rg3給予可調(diào)節(jié)肝內(nèi)脂滴的積聚和肝細(xì)胞的組織病理學(xué)變化。此外，這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，Rg3 在成年斑馬魚的腸道中轉(zhuǎn)化為 Rh2 和 PPD。 有必要對(duì)斑馬魚血液、組織和器官中 Rg3 的吸收、代謝和積累進(jìn)行進(jìn)一步研究。這項(xiàng)工作的觀察結(jié)果有助于闡明給予Rg3用于肥胖預(yù)防或治療的潛力。
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