如今，RNA干擾技術(shù)被越來越多地用于調(diào)控人類基因的表達(dá)。動植物存在一類長度約為22 nt的非編碼單鏈RNA分子microRNA（miRNA），能夠通過RNAi參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控?？蒲腥藛T在線蟲系統(tǒng)性RNAi的研究中發(fā)現(xiàn)，跨膜蛋白SID-1（systemic RNA interference defective protein 1）在介導(dǎo)外源雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）的吸收方面具有重要作用，是重要的核酸轉(zhuǎn)運通道。在哺乳動物細(xì)胞中，存在與SID-1有相似核酸轉(zhuǎn)運功能的兩個同源跨膜蛋白——SIDT1和SIDT2（SID1 transmembrane family member 1/2）。SIDT2參與細(xì)胞內(nèi)DNA/RNA自噬過程，并將溶酶體內(nèi)化的核酸轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)，引發(fā)先天免疫反應(yīng)；SIDT1更是直接介導(dǎo)食物性來源miRNA的吸收。研究發(fā)現(xiàn)，胃部是吸收食物小RNA的主要部位，在哺乳動物的胃粘膜頂細(xì)胞（pit cell）上表達(dá)的SIDT1是吸收外源小RNA的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。這一過程在極低pH的胃酸環(huán)境下得到顯著促進(jìn)，且酸刺激極大程度地促進(jìn)了miRNA的吸收。這一發(fā)現(xiàn)為小RNA的“跨界調(diào)控”提供了進(jìn)一步的證據(jù)，為基于小RNA的治療提供了新策略，并為基于RNA的藥物開發(fā)提供了潛在方向。雖然越來越多的相關(guān)研究均支持哺乳動物SID-1跨膜家族蛋白SIDT1和SIDT2介導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)運，但是SID-1跨膜家族蛋白SIDT1和SIDT2介導(dǎo)異源小RNA吸收的分子機(jī)制仍然不夠清晰，特別是關(guān)于低pH條件下促進(jìn)小RNA吸收過程的機(jī)制仍然未知。
中國科學(xué)院生物物理研究所孫飛課題組聯(lián)合南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院籍曉云課題組、張辰宇課題組，在《細(xì)胞研究》（Cell Research）上，在線發(fā)表了題為Cryo-EM structures of human SID-1 transmembrane family proteins and implications for their low-pH-dependent RNA transport activity的研究論文。該研究利用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)，首次同時解析了人源SIDT1和SIDT2蛋白質(zhì)的同源二聚體三維結(jié)構(gòu)。本研究首次發(fā)現(xiàn)，SIDT1和SIDT2可以以pH依賴的方式結(jié)合miRNA，并誘發(fā)SIDT1和SIDT2的進(jìn)一步寡聚化。該成果從分子層面揭示了酸性環(huán)境促進(jìn)小RNA吸收的分子機(jī)理，剖析了SIDT1和SIDT2介導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)運的潛在分子機(jī)制，對探究SIDT1和SIDT2在酸性微環(huán)境中的功能調(diào)控以及RNA遞送系統(tǒng)的開發(fā)具有潛在意義。
科研團(tuán)隊攻克了膜蛋白樣品表達(dá)純化的困難以及在冷凍樣品制備過程中存在的嚴(yán)重取向優(yōu)勢等難題，利用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)獲得了人源SIDT1和SIDT2的三維結(jié)構(gòu)。SIDT1和SIDT2均含有一個胞外結(jié)構(gòu)域（extracellular domain，ECD）、一個由11次跨膜螺旋組成的跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain， TMD），以及一個柔性的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（intracellular domain，ICD）。研究通過結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)SIDT1和SIDT2的結(jié)構(gòu)高度相似，這提示它們可能具有相似的生物學(xué)功能。同時，研究還發(fā)現(xiàn)了進(jìn)化保守的位點如二硫鍵和糖基化位點。它們對SIDT1和SIDT2酸性條件下的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)完整性起著重要作用。此外，研究人員檢測了SIDT1和SIDT2在體外和活細(xì)胞中的聚合狀態(tài)。結(jié)果表明，這兩種蛋白質(zhì)均以二聚體或寡聚體的形式存在，且TMD對于維持二聚體至關(guān)重要。上述成果為闡釋SIDT1和SIDT2在體內(nèi)的功能提供了重要信息。
為了揭示SIDT1和SIDT2介導(dǎo)小RNA轉(zhuǎn)運的分子機(jī)制，研究進(jìn)一步探討了它們的ECD與小RNA的結(jié)合情況。實驗結(jié)果顯示，SIDT1和SIDT2的ECD能夠以pH依賴性方式有效地與小RNA結(jié)合。在酸性條件下，ECD與小RNA的親和力增加，且這種結(jié)合進(jìn)一步引發(fā)了ECD的寡聚化。這推翻了前期報道的SIDT1ECD和SIDT2ECD只能結(jié)合較長的雙鏈RNA（>100 bp）的觀點。同時，研究還發(fā)現(xiàn)，ECD蛋白在酸性條件下與核酸的結(jié)合，不受核酸種類、單雙鏈的特異性影響，且這種結(jié)合存在pH依賴性。通過分析型超速離心和凝膠過濾層析分析，研究發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，SIDT1和SIDT2與核酸結(jié)合能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的寡聚化，這表明它們具有形成核酸孔道的潛力。該研究揭示了低pH環(huán)境在促進(jìn)SIDT1和SIDT2吸收外源小RNA的關(guān)鍵作用，深化了在低pH條件下促進(jìn)小RNA的跨膜吸收的分子機(jī)制理論基礎(chǔ)。
綜上，該研究解析了哺乳動物細(xì)胞跨膜家族蛋白SIDT1和SIDT2的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并首次提出了SIDT1和SIDT2與RNA的pH依賴性結(jié)合和寡聚化的分子特征。因此，該成果為SID-1跨膜家族蛋白在核酸轉(zhuǎn)運方面奠定了分子基礎(chǔ)，并為“基因跨界調(diào)控”現(xiàn)象提供了直接的理論分子依據(jù)。
研究工作獲得國家重點研發(fā)計劃和國家自然科學(xué)基金等的支持。部分樣品制備、數(shù)據(jù)收集和分析等工作得到生物物理所蛋白質(zhì)科學(xué)研究平臺生物成像中心的協(xié)助。上海科技大學(xué)的科研人員參與研究。
SIDT1和SIDT2同源二聚體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)
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