TEL:17312606166（魏經(jīng)理）
美鳳力臨床前大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心
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摘要：斑馬魚具有增殖快、與人類基因同源性高等優(yōu)點(diǎn)，是研究心血管疾病必不可少的模式生物。斑馬魚胚胎/幼蟲是毒理學(xué)研究中有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用于分析藥物毒性，包括肝毒性、腎毒性和心臟毒性，以及臨床前階段的藥物發(fā)現(xiàn)和藥物安全篩選。心率 (HR) 可作為心臟毒性研究的功能終點(diǎn)，而心率變異性 (HRV) 可作為心律失常的指標(biāo)。心臟毒性是藥物試驗(yàn)早期和晚期終止的主要原因，因此更全面地了解斑馬魚HR和HRV非常重要。本文介紹了心率和心率變異性在特定領(lǐng)域的應(yīng)用，重點(diǎn)介紹了斑馬魚心跳檢測(cè)程序、信號(hào)分析技術(shù)和成熟的商業(yè)軟件，如LabVIEW、Rvlpulse和ZebraLab。我們還比較了 HR 檢測(cè)算法和基于心電圖 (ECG) 的心臟信號(hào)檢測(cè)方法。還系統(tǒng)地分析了 HR 和 HRV 之間的關(guān)系； HR被證明與HRV呈負(fù)相關(guān)。本文還重點(diǎn)介紹了藥物測(cè)試的應(yīng)用。 此外，HR 和 HRV 被證明受自動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)；本文還總結(jié)了其與ECG測(cè)量的聯(lián)系。
關(guān)鍵詞：斑馬魚心率檢測(cè) HR HRV ECG 自主神經(jīng)系統(tǒng) 心血管疾病
簡(jiǎn)介：斑馬魚作為一種脊椎動(dòng)物，在毒理學(xué)、致畸學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和藥理學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。斑馬魚模型的其他應(yīng)用不斷涌現(xiàn)，因?yàn)槠鋬?yōu)勢(shì)包括胚胎發(fā)育快、身體透明以及與人類的高度遺傳同源性。斑馬魚心臟是第一個(gè)發(fā)育的器官，對(duì)于研究心臟病和心臟毒性的電生理學(xué)非常有用。此外，我們的實(shí)驗(yàn)室還證明斑馬魚是研究小分子和肽/蛋白質(zhì)生物制劑對(duì)心臟毒性和心臟保護(hù)的藥理作用的一個(gè)非常強(qiáng)大和方便的模型。心跳和超聲心動(dòng)圖（ECG）通常用于量化和臨床評(píng)估心臟異常； 然而，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和信號(hào)處理是圖像采集方法的一大挑戰(zhàn)。與手動(dòng)檢測(cè)和觀察相比，自動(dòng)HR檢測(cè)顯示出極大的優(yōu)勢(shì)。心血管疾病（CVD）通常用于指各種疾病，包括高血壓、冠心病、外周血管疾病、心力衰竭、風(fēng)濕性心臟病、先天性疾病和心肌病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，心血管疾病是全球死亡的主要原因，占全球所有死亡人數(shù)的 31%，包括心源性猝死。在中國(guó)，心血管疾病占所有死亡人數(shù)的40%，給醫(yī)療服務(wù)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。流行病學(xué)研究表明，心血管疾病（包括冠心病、心源性猝死、心力衰竭、心房顫動(dòng)和中風(fēng)）的風(fēng)險(xiǎn)增加與較高的靜息心率（HR）有關(guān)。冠狀動(dòng)脈疾病、心肌病、先天性心臟病、心臟瓣膜缺陷和心律失常是心血管疾病死亡和中風(fēng)的主要原因?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)量各種CVD動(dòng)物模型的心率和心率變異性（HRV）來(lái)評(píng)估CVD相關(guān)疾病。因此，自動(dòng)準(zhǔn)確的心率檢測(cè)和心率變異性分析值得更多的關(guān)注和深入研究。以前的斑馬魚研究主要集中在心臟再生； 很少有人提到 HR 或 HRV，這就解釋了我們?yōu)槭裁催M(jìn)行這項(xiàng)研究，即總結(jié)斑馬魚心臟 HR 和 HRV 測(cè)量的最新進(jìn)展。開(kāi)創(chuàng)性的研究在斑馬魚表型特征評(píng)估方面取得了相當(dāng)大的成功，并且引入了許多軟件包和工具集來(lái)支持自動(dòng)圖像處理，例如FishInspector，一種自動(dòng)特征檢測(cè)圖形用戶界面。另一個(gè)團(tuán)隊(duì)使用最先進(jìn)的技術(shù)調(diào)查了許多用于斑馬魚圖像處理的工具，但很少有免費(fèi)用于教育和研究目的的工具； 大多數(shù)僅可用于商業(yè)用途。我們總結(jié)了最近的斑馬魚心跳檢測(cè)和HRV評(píng)估工具，以更全面地了解斑馬魚心率檢測(cè)和心臟電生理信號(hào)分析，包括其在藥物篩選中的應(yīng)用。檢測(cè)斑馬魚心率的現(xiàn)有方法和工具可分為以下幾類：1） 心電圖（ECG）；2） 半自動(dòng)檢測(cè)軟件；3） 自動(dòng)檢測(cè)圖形用戶界面；4） LabVIEW軟件（結(jié)合視頻采集設(shè)備）；5）人工計(jì)數(shù)。半自動(dòng)和自動(dòng)檢測(cè)算法是用于短期視頻記錄的無(wú)創(chuàng)技術(shù)，似乎適合評(píng)估斑馬魚心率。LabVIEW 系列在視頻/圖像采集方面表現(xiàn)良好，包括 HR 和 HRV 分析，但價(jià)格昂貴。人工計(jì)數(shù)是勞動(dòng)密集型和繁瑣的，并且難以應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)背景下的高通量篩選。與 HR 相比，涉及 HRV 的斑馬魚心臟研究較少。 HRV 被公認(rèn)為預(yù)測(cè) CVD 風(fēng)險(xiǎn)和其他由異常自動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng) (ANS) 調(diào)節(jié)引起的相關(guān)疾病的重要參數(shù)。
基于圖像的心率分析：斑馬魚心臟信號(hào)提取和處理的開(kāi)創(chuàng)性研究引入了許多方法，包括初級(jí)斑馬魚養(yǎng)殖、原始圖像和視頻數(shù)據(jù)采集、ROI 定義以及 PCA 和 ICA 的方法。在下面我們首次系統(tǒng)地總結(jié)了這些方法。
原始數(shù)據(jù)采集：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集主要通過(guò)單平臺(tái)圖像/視頻采集和高通量篩選批量采集完成。逐拍視頻通常在受精后3到4天的斑馬魚幼蟲中采集。斑馬魚胚胎是通過(guò)成對(duì)和分批雜交收集的。在受精后24小時(shí)（hpf），用0.003%的PTU處理胚胎以防止色素形成。斑馬魚胚胎通常在E3培養(yǎng)基中保存在28°C以下。由配備數(shù)碼相機(jī)的基本光學(xué)顯微鏡或具有高分辨率記錄功能的顯微鏡獲取圖像/視頻；在以前的研究中，最好使用640×480像素或更高分辨率的自動(dòng)顯微鏡每秒15/30幀。
顏色格式：斑馬魚HR數(shù)據(jù)可以從視頻或圖像中提取。這些數(shù)據(jù)有助于定位ROI，例如心臟或流動(dòng)的血管。LAB顏色空間是用于信號(hào)分析的顏色空間之一，通過(guò)分離內(nèi)部亮度通道來(lái)工作。其他顏色格式包括RGB、CMYK和灰度。對(duì)于顏色格式化，不同的檢測(cè)方法關(guān)注不同顏色通道中像素強(qiáng)度的變化。這些變化發(fā)生在一個(gè)視頻的連續(xù)幀之間，有助于定義ROI。比較來(lái)自同一視頻的所有圖像。結(jié)果表明，LAB顏色格式有利于識(shí)別不同的區(qū)域。大多數(shù)以前的選擇方法將圖像或視頻顏色轉(zhuǎn)換為灰度格式，即具有閾值設(shè)置的二值圖像?；叶仁怯糜谛盘?hào)處理的最常用的圖像處理方法。
ROI檢測(cè)：ROI是指圖像中包含最重要特征或變化最多的區(qū)域； 這可能是斑馬魚的大腦、尾巴或心臟區(qū)域。在斑馬魚心跳檢測(cè)過(guò)程中，心房和心室的跳動(dòng)會(huì)改變連續(xù)視頻幀中的亮度或暗強(qiáng)度，可以用圓圈或其他形狀來(lái)劃分，從而生成ROI。以前的研究手動(dòng)繪制ROI，而后來(lái)的研究則側(cè)重于隨著時(shí)間的推移自動(dòng)生成ROI。他們開(kāi)發(fā)了一種算法來(lái)根據(jù)預(yù)定義的 ROI 定義更具適應(yīng)性的 ROI，以實(shí)現(xiàn)可靠的斑馬魚 HR 估計(jì)和檢測(cè)。識(shí)別像素強(qiáng)度變化是定義ROI最有用的策略。另一個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)斑馬魚體內(nèi)的紅細(xì)胞、色素和碎片的變化會(huì)在視頻中產(chǎn)生像素強(qiáng)度的變化，有助于確定ROI。使用亮度強(qiáng)度變化來(lái)識(shí)別漂移的心臟區(qū)域，并計(jì)算選定區(qū)域的總亮度。通過(guò)在選定區(qū)域生成遮罩來(lái)處理像素強(qiáng)度。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一個(gè)程序來(lái)檢測(cè)斑馬魚的心臟運(yùn)動(dòng)，包括收縮和舒張間期、心率和心律失常；總之，證據(jù)表明基于像素強(qiáng)度的策略對(duì)于識(shí)別斑馬魚心臟區(qū)域和提取所需信號(hào)是有效的。
信號(hào)提取：定義合適的 ROI 后，下一步是提取信號(hào)。 Pylatiuk 描述了基于計(jì)算視頻中連續(xù)幀之間的 ROI 標(biāo)準(zhǔn)偏差的心跳檢測(cè)，并將時(shí)間序列數(shù)據(jù)與提取的心跳信號(hào)相結(jié)合。 然后導(dǎo)出以時(shí)間[s]為橫軸，像素強(qiáng)度變化為縱軸的圖表。相鄰的兩個(gè)心跳信號(hào)最大峰值代表心跳間隔。Krishna首次利用多通道ICA分析斑馬魚HR。此外，PCA 用于從 R、G 和 B 通道中提取信息，提取的最大方差代表斑馬魚心臟活動(dòng)。ICA算法有助于使用單個(gè)通道從未知分量的線性混合中估計(jì)信號(hào)。2018年，該團(tuán)隊(duì)提出了一種新的基于強(qiáng)度的方法，結(jié)合像素強(qiáng)度變化和時(shí)間序列數(shù)據(jù)來(lái)生成功率譜密度（PSD），其峰值對(duì)HR有貢獻(xiàn)。
信號(hào)分析：信號(hào)分析是在圖像處理過(guò)程中獲得斑馬魚 HR 的關(guān)鍵。Pylatiuk利用LabVIEW和MATLAB設(shè)計(jì)了一個(gè)用戶友好的圖形界面，讓研究人員能夠獲得自己的斑馬魚原始數(shù)據(jù)。當(dāng)與視頻中的時(shí)間序列數(shù)據(jù)相結(jié)合時(shí)，PSD 是一種提取重要信息的有效策略。 信號(hào)密度在縱軸上，時(shí)間在橫軸上。根據(jù)PSD數(shù)據(jù)中的局部最大值（峰值）計(jì)算心跳。采用FFT獲取ICA的三通道功率譜。每個(gè)通道中最高的 PSD 記錄在每一幀中，這有助于揭示 HR 的模式。斑馬魚心率檢測(cè)過(guò)程已逐漸標(biāo)準(zhǔn)化。許多研究基于像素強(qiáng)度變化和亮度變化，使用不同的顏色格式來(lái)幫助定義ROI。在信號(hào)提取和分析方面，通過(guò)PCA和ICA逐步從ROI中提取最重要的信息。PSD和FFT是將信息轉(zhuǎn)換為易于操作的格式的主要方法。進(jìn)一步處理斑馬魚的心臟信號(hào)以檢測(cè)心率。另一個(gè)新興趨勢(shì)是第三方商業(yè)化軟件包的發(fā)展。 使用這些軟件包的圖形用戶界面 (GUI) 實(shí)現(xiàn)了令人難以置信的省力優(yōu)勢(shì)。最常用的軟件包是 ViewPoint 公司的 LabVIEW和 MicroZebraLab，專門從事斑馬魚心臟病學(xué)和生理學(xué)分析。 這些軟件包有助于檢測(cè)心跳和血流。使用商業(yè)軟件 DanioScope? 可以在幾分鐘內(nèi)完成從視頻錄制到 HR 提取的整個(gè)過(guò)程。斑馬魚心率是反映心臟對(duì)環(huán)境反應(yīng)的一個(gè)重要參數(shù)，促進(jìn)臨床試驗(yàn)前心臟病藥物篩選。這些最先進(jìn)的技術(shù)在過(guò)去的二十年里都取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。斑馬魚 HR 檢測(cè)對(duì)于藥物篩選和臨床前研究很重要。 斑馬魚和人類的心臟病表現(xiàn)出高度相似性。斑馬魚的心律失常，包括心動(dòng)過(guò)速和竇性心動(dòng)過(guò)緩。鎮(zhèn)靜劑、麻醉劑和心臟毒性藥物，如MS-222、PTU、可卡因、嗎啉、普萘洛爾、特非那定和異丙腎上腺素，是實(shí)驗(yàn)室測(cè)試最廣泛的藥物。例如，MS-222可以降低斑馬魚的心率，從而導(dǎo)致心動(dòng)過(guò)緩。此前的一項(xiàng)研究調(diào)查了可卡因及其與其他藥物聯(lián)合治療對(duì)斑馬魚心臟的影響?？煽ㄒ騿为?dú)導(dǎo)致心律失常，高劑量導(dǎo)致心動(dòng)過(guò)緩。
ECG：ECG 是一種廣泛使用的技術(shù)，用于記錄和分析心臟動(dòng)作電位 (AP) 和電生理信號(hào)。根據(jù)先前的研究，這些信號(hào)有助于計(jì)算人類和成年斑馬魚的 HR 和 HRV。 根據(jù)心電圖分析，斑馬魚對(duì)化學(xué)物質(zhì)和藥物的心臟生理反應(yīng)與人類相似，從而產(chǎn)生相似的信號(hào)特征，包括心臟去極化、復(fù)極化和傳導(dǎo)。有證據(jù)表明，斑馬魚心臟的電生理行為與人類心臟非常相似。降低人類 HR 心室 AP 的藥物，如利多卡因、尼群地平和硝苯地平，以及延長(zhǎng) AP 的藥物，如特非那定，對(duì)斑馬魚心室有類似的影響。大多數(shù)研究創(chuàng)建和應(yīng)用圖形用戶界面（GUI）以清楚地顯示 HR 和 HRV 的心電圖分析結(jié)果。 P波、QRS波群、T波、PR間期、RR間期和QT間期等參數(shù)可以通過(guò)GUI顯示，便于計(jì)算HRV。作為常見(jiàn)的參考指標(biāo)，QT間期與長(zhǎng)QT綜合征（LQT）和QTc直接相關(guān)。LQT 的特點(diǎn)是 HR 相關(guān)的 QT 間期延長(zhǎng)和 T 波異常。 它反映心臟電生理障礙，是室性心動(dòng)過(guò)速的危險(xiǎn)因素，甚至可導(dǎo)致猝死。有證據(jù)表明，心電圖是量化斑馬魚 HR 和分析 HRV 的有用技術(shù)，可提供有關(guān)電生理動(dòng)力學(xué)的信息。為了獲取斑馬魚的ECG數(shù)據(jù)，通常將針電極傳感器或可穿戴設(shè)備插入心臟區(qū)域，包括心房和心室。這些傳感器通過(guò) ECG 獲取數(shù)據(jù)以進(jìn)行進(jìn)一步處理。 傳感器通常連接到信號(hào)放大器以增強(qiáng)信號(hào)。此外，可以從這些處理信號(hào)中獲得P波、T波、QRS間期、RR間期和QT間期之間的時(shí)間延遲。 HR 和 HRV 分析受益于這些信號(hào)。在信號(hào)處理過(guò)程中，使用LabVIEW和MATLAB等商用軟件對(duì)信號(hào)進(jìn)行采集、顯示和分析。設(shè)計(jì)了一種新的傳感器微電極陣列（MEA）膜，并將其放置在斑馬魚心臟的尾部，以將信號(hào)傳送到LabVIEW GUI進(jìn)行進(jìn)一步處理。這允許實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和處理斑馬魚HR和HRV。一項(xiàng)研究將該技術(shù)應(yīng)用于藥物測(cè)試，即研究 MS-222 對(duì)清醒斑馬魚的影響。在無(wú)創(chuàng)數(shù)據(jù)采集方面取得了顯著的進(jìn)步。傳感器旨在記錄心電圖活動(dòng)并監(jiān)測(cè)斑馬魚心臟活動(dòng)。此外，切除成年斑馬魚的心室，通過(guò)觀察心電圖中的心室去極化和復(fù)極，研究心臟再生和斑馬魚心律的變化。HR和HRV對(duì)于評(píng)估斑馬魚的心臟功能至關(guān)重要。心電圖也存在局限性；斑馬魚的小尺寸和侵入性切口可能導(dǎo)致心室破裂，這對(duì)HR和HRV分析的準(zhǔn)確性有重大影響?？傮w而言，ECG是檢測(cè)斑馬魚心率和分析心率變異性的重要技術(shù)；它對(duì)藥物引起的變化高度敏感。
斑馬魚心率檢測(cè)研究進(jìn)展：心率是心臟活動(dòng)的重要指標(biāo)。斑馬魚HR已被廣泛用作藥物毒性的指標(biāo)。先前的研究產(chǎn)生了各種HR測(cè)量方法，包括初始手動(dòng)計(jì)數(shù)、半自動(dòng)檢測(cè)算法和自動(dòng)算法。還開(kāi)發(fā)了第三方軟件來(lái)評(píng)估斑馬魚的HR。最近，在自動(dòng)批量篩選和處理方面取得了良好進(jìn)展，提高了 HR 量化效率。Viewpoint是一家提供行為分析工具的成熟技術(shù)公司，專注于斑馬魚胚胎和仔魚的研究，開(kāi)發(fā)了一些軟件包，如Microzebralab和Zebralab，以直接或間接檢測(cè)HR。此外，臺(tái)灣公司RasVector Technology Inc.開(kāi)發(fā)了RvVisualPulse軟件，通過(guò)視頻記錄快速測(cè)量心跳。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，測(cè)量不是獨(dú)立的，可以結(jié)合多種技術(shù)來(lái)全面了解斑馬魚心率。LabVIEW在這方面發(fā)揮著重要作用，是一個(gè)允許信號(hào)處理和提供可視化界面的平臺(tái)。LabVIEW常用來(lái)分析心電圖數(shù)據(jù)，使HR檢測(cè)更加方便。ECG 技術(shù)以及商業(yè)軟件和工具包的組合經(jīng)常用于量化成年斑馬魚心臟的活動(dòng)。
HRV：在過(guò)去的三十年里，斑馬魚 HR 檢測(cè)方法在速度、便利性和準(zhǔn)確性方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。 HRV是指心跳之間時(shí)間間隔的變化，以及心跳規(guī)律性，而HR代表每分鐘的心跳次數(shù)（bpm）。HRV被定義為節(jié)律指數(shù)。HRV是心肌梗死、心律失常、心律失常、心房顫動(dòng)和慢性心力衰竭等心臟功能障礙的重要指標(biāo)。HRV經(jīng)常用于評(píng)估藥物的有效性。一些研究表明，較低的HRV預(yù)示著較高的心血管發(fā)病率和死亡率，表明HRV的生理重要性。在藥物的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，心率變異性檢測(cè)越來(lái)越受到重視。RR間期代表兩個(gè)連續(xù)R波之間的時(shí)間。 因此，HRV 反映了 RR 間期的變化。心率變異性是心臟異常的重要臨床指標(biāo)。對(duì)于ECG 數(shù)據(jù)的 HRV 分析，基于 MATLAB 的軟件是有效的。 已開(kāi)發(fā)出微調(diào)分析軟件，可自動(dòng)處理、分類、分析和顯示心電圖信號(hào)。有幾種工具用于HRV分析，包括LabVIEW、aHRV、Kubios HRV、HRV工具包、Kaplan軟件、gHRV和PhysioZoo；所有這些應(yīng)用程序都有GUI，易于操作。
HR 和HRV關(guān)系：眾所周知，HR與HRV呈負(fù)相關(guān)； 較低的 HR 對(duì)應(yīng)較高的 HRV，而 HRV 可以從 HR 中計(jì)算出來(lái)。 HR 還影響 HRV 作為心血管因素的預(yù)測(cè)能力。1996 年，歐洲心臟病學(xué)會(huì)工作組使用 HRV 來(lái)描述瞬時(shí) HR 和 RR 間期。首次在清醒成年大鼠和人中系統(tǒng)分析了HRV和HR之間的關(guān)系。報(bào)告稱較低的 HR 會(huì)導(dǎo)致較高的 HRV，并且 HR 不能作為自主神經(jīng)活動(dòng)的可靠標(biāo)志，因?yàn)樗赡芤蛏矬w而異。多項(xiàng)研究通過(guò)線性/非線性回歸分析表明 HRV 與 HR 呈負(fù)相關(guān)。
結(jié)論：斑馬魚 HR 檢測(cè)與 HRV 相結(jié)合可以深入了解心血管風(fēng)險(xiǎn)。 在本次調(diào)查中，我們總結(jié)了 HRV、ANS、PNS 和 SNS 之間的聯(lián)系，以及 HR 和 HRV 之間的關(guān)系。我們希望斑馬魚將成為CVD領(lǐng)域更易獲得的藥物篩選生物體， HR和HRV分析可用于臨床前研究。許多常用于斑馬魚HR檢測(cè)和HRV分析的工具也可用于其他動(dòng)物物種的廣泛生理分析。
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