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美鳳力臨床前大動物實(shí)驗(yàn)中心
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摘要：帕金森病（PD）的特征是黑質(zhì)（SN）多巴胺能（DA）神經(jīng)元的缺失和α-突觸核蛋白（α-syn）的聚集。目前的 PD 療法僅提供癥狀緩解，缺乏可以逆轉(zhuǎn)正在進(jìn)行的神經(jīng)退行性變的疾病緩解治療策略。在探索新的疾病治療策略過程中，來自天然來源的化合物近來備受關(guān)注。YIAEDAER（Tyr-Ile-Ala-Glu-Asp-Ala-Glu-Arg）肽是從海洋蝸牛（NAC）的內(nèi)臟物質(zhì)提取物中分離純化的一種多功能肽，具有豐富的藥理活性，但其對MPTP誘導(dǎo)的PD模型的神經(jīng)保護(hù)作用尚未見報道。研究發(fā)現(xiàn)YIAEDAER肽聯(lián)合治療可以抑制MPTP誘導(dǎo)的斑馬魚運(yùn)動損傷，改善MPTP誘導(dǎo)的DA神經(jīng)元變性，抑制血管系統(tǒng)及腦血管的喪失，抑制α-syn水平。此外，YIAEDAER肽調(diào)節(jié)與自噬（α-syn、pink1、parkin、atg5、atg7、beclin1、ulk1b、ulk2和ambra1a）和氧化應(yīng)激（sod1、sod2、gss、gpx4a、gsto2和cat）相關(guān)的幾個基因。因此，我們的發(fā)現(xiàn)表明，YIAEDAER肽可能是對抗MPTP誘導(dǎo)的PD樣疾病的潛在治療候選物。
關(guān)鍵詞：MPTP α-突觸核蛋白 天然產(chǎn)物 自噬 氧化應(yīng)激 斑馬魚
簡介：帕金森病 (PD) 是第二常見的破壞性神經(jīng)退行性疾病，目前尚無有效的治療選擇。帕金森病的神經(jīng)病理學(xué)特征包括多巴胺能（DA）神經(jīng)元的逐漸喪失，伴隨著神經(jīng)元胞體和突起中路易小體的積累，以纖維α-突觸核蛋白聚集體為主。大多數(shù)PD病例是散發(fā)性的，而5–10%的PD病例被認(rèn)為是由特定基因的遺傳突變引起的，包括SNCA（一種編碼α-syn的基因）、富含亮氨酸重復(fù)激酶2（lrrk2）、Parkin（Parkin）（Parkin）和磷酸酶和張力蛋白同源物（pten）誘導(dǎo)的假定激酶1（pink1）。帕金森病伴有運(yùn)動和非運(yùn)動癥狀。運(yùn)作癥狀主要表現(xiàn)為運(yùn)動障礙，表現(xiàn)出運(yùn)動遲緩、靜止性震顫和強(qiáng)直等主要運(yùn)動癥狀。然而，非運(yùn)動癥狀，包括注意力下降、REM睡眠行為障礙和嗅覺減退，可能比運(yùn)動癥狀早幾年。其他非運(yùn)動癥狀也可能出現(xiàn)，在疾病晚期，會出現(xiàn)姿勢不穩(wěn)和癡呆。運(yùn)動癥狀只有在50-60%的DA神經(jīng)元變性時才會出現(xiàn)，從而使紋狀體中的多巴胺含量降低70-80%，導(dǎo)致基底節(jié)活動失調(diào)。盡管在精確理解帕金森病神經(jīng)退行性變過程相關(guān)的分子途徑方面取得了令人信服的進(jìn)展，但尚未開發(fā)出能夠改變帕金森病進(jìn)展的治療干預(yù)措施。這反映出迫切需要開發(fā)新的抗PD療法，有效地阻止疾病的進(jìn)展。在探索新的 PD 療法的過程中，來自自然資源的化合物在近來受到了越來越多的關(guān)注。在當(dāng)前研究中感興趣的化合物是YIAEDAER肽，它是一種多功能肽，從海海洋蝸牛的內(nèi)臟物質(zhì)提取物（NAC）中分離和純化。NAC是一種具有很高營養(yǎng)價值和商業(yè)價值的海生蝸牛；然而，對其活性肽知之甚少。早期的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)從NAC的肉和內(nèi)臟中分離出YIAEDAER肽，并報道了其抗氧化、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制和抗糖尿病活性。YIAEDAER肽由Tyr-Ile-Ala-Glu-Asp-Ala-Glu-Arg組成，分子量為965 Da。 研究發(fā)現(xiàn)，YIAEDAER 肽的觀察到的生物活性歸因于其低分子量、高比例的疏水性和帶負(fù)電荷的氨基酸，以及特定的 C 端和 N 端氨基酸。神經(jīng)毒素MPTP被廣泛用于誘導(dǎo)PD，導(dǎo)致SN中DA神經(jīng)元選擇性變性，主要通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物1（通過單胺氧化酶B產(chǎn)生的有毒代謝物MPP+）來重現(xiàn)帕金森病癥狀。斑馬魚是一種淡水魚，近年來作為一種強(qiáng)大的體內(nèi)脊椎動物模型生物而受到越來越多的關(guān)注，可治療多種神經(jīng)退行性疾病。斑馬魚模型經(jīng)濟(jì)，易于飼養(yǎng)，與人類的遺傳相似性超過 80%。盡管斑馬魚和人類之間存在進(jìn)化距離，但斑馬魚基因相對于人類同源基因在功能上是保守的，因此它們表現(xiàn)出與人類相似的神經(jīng)退化表型。值得注意的是，斑馬魚擁有脊椎動物的神經(jīng)結(jié)構(gòu)組織，所有的主要結(jié)構(gòu)都與哺乳動物的大腦相似。斑馬魚已針對幾種中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 疾病進(jìn)行建模，包括癲癇、阿爾茨海默病 (AD)、創(chuàng)傷性腦損傷 (TBI) 和 PD。斑馬魚作為珍貴模型的潛力為未來的神經(jīng)科學(xué)研究增添了新的見解。與嚙齒動物模型相比，斑馬魚整個胚胎發(fā)育過程中的快速神經(jīng)發(fā)育和光學(xué)透明性使其成為研究 PD 相關(guān)疾?。ㄈ?PD）的合適模型。馬魚PD模型成為一種廣泛接受的可靠模型，可以研究抗PD化合物及其相關(guān)的潛在機(jī)制。在目前的研究中，我們評估了YIAEDAER肽對MPTP誘導(dǎo)的斑馬魚PD模型的神經(jīng)保護(hù)作用，并研究了YIAEDAER肽抗PD作用背后的潛在機(jī)制。
YIAEDAER聯(lián)合治療對MPTP誘導(dǎo)的運(yùn)動障礙的影響：為了評估YIAEDAER肽的聯(lián)合治療是否能改善MPTP誘導(dǎo)的運(yùn)動損傷，我們在120 hpf時對斑馬魚仔魚進(jìn)行了行為評估，這是斑馬魚表現(xiàn)出最大自發(fā)運(yùn)動的最早時間點(diǎn)。與對照組相比，MPTP治療組的總行程顯著縮短。相反，與YIAEDAER肽的聯(lián)合治療逆轉(zhuǎn)了MPTP誘導(dǎo)的總行程縮短。然而，與 MPTP 組相比，僅10 μg/mL 和 50 μg/mL 的 YIAEDAER組顯示總行駛距離顯著上升。此外，斑馬魚的游泳速度與總行程呈相似的模式。 2 μg/mL、10 μg/mL和 50 μg/mL的YIAEDAER均逆轉(zhuǎn)了MPTP誘導(dǎo)的游泳速度下降，反映YIAEDAER肽對運(yùn)動模式具有保護(hù)作用。綜上所述，結(jié)果表明 YIAEDAER 肽改善了 MPTP 誘導(dǎo)的斑馬魚運(yùn)動活動的降低。
圖1、試驗(yàn)流程圖
圖 2、 YIAEDAER 對斑馬魚仔魚 PD 樣行為的緩解作用。
YIAEDAER聯(lián)合治療對斑馬魚仔魚對刺激的反應(yīng)損傷的影響：圖3顯示了120 hpf仔魚在10min 的最少適應(yīng)后，突然從黑暗變?yōu)楣饷鲿r的60min內(nèi)的運(yùn)動輸出特征模式。對照組的仔魚在黑暗期運(yùn)動能力急劇增加后逐漸減少，而MPTP處理的斑馬魚的運(yùn)動能力并沒有明顯增加。簡而言之，對照和 50 μg/mL 的 YIAEDAER肽組斑馬魚在明亮刺激后的反應(yīng)能力增強(qiáng)。
圖3、YIAEDAER聯(lián)合治療對斑馬魚仔魚對刺激的反應(yīng)損傷的影響。
YIAEDAER 對 MPTP 誘導(dǎo)的 DA 神經(jīng)元和血管損失的影響：MPTP導(dǎo)致斑馬魚DA神經(jīng)元顯著缺失。為了評估YIAEDAER肽對MPTP誘導(dǎo)的DA神經(jīng)元丟失的抑制作用，我們使用轉(zhuǎn)基因系Vmat2:GFP進(jìn)行了評估。96 hpf 的 MPTP 組斑馬魚顯示 DA 神經(jīng)元區(qū)域的長度和熒光密度降低，這與我們早期的研究相似。與YIAEDAER肽的聯(lián)合治療以濃度依賴性方式逆轉(zhuǎn)了斑馬魚中腦的這種減少，如紅色方框所示。在96 hpf的轉(zhuǎn)基因斑馬魚（Fli1:GFP）中評估了YIAEDAER肽對MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)血管系統(tǒng)的保護(hù)作用。在目前的研究中，MPTP給藥導(dǎo)致了腦血管的顯著損失，如圖4D中的紅色箭頭所示，與早期記錄的研究相證實(shí)。另一方面，如藍(lán)色箭頭所示，與 YIAEDAER 肽（2 μg/mL、10 μg/mL 和 50 μg/mL）共同處理可保護(hù) MPTP 誘導(dǎo)的脈管系統(tǒng)喪失和脈管系統(tǒng)紊亂。
圖 4、 YIAEDAER肽對斑馬魚 PD 模型中 DA 神經(jīng)元和血管的保護(hù)作用。
YIAEDAER肽對斑馬魚仔魚α-syn水平的調(diào)節(jié)作用：如紅色箭頭所示，與對照組相比，經(jīng)MPTP處理的斑馬魚仔魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的α-syn表達(dá)增加。在72 hpf下，通過斑馬魚仔魚上的綠色箭頭觀察到Y(jié)IAEDAER聯(lián)合治療組的α-syn水平明顯降低。此外，與 MPTP 組相比，YIAEDAER 肽 (2 μg/mL)、(10 μg/mL) 和 (50 μg/mL) 以劑量依賴性方式顯著抑制 α-syn 的表達(dá)。
圖 5、 YIAEDAER肽通過調(diào)節(jié)斑馬魚仔魚 α-syn 水平對 PD 樣癥狀起緩解作用。
YIAEDAER 肽對斑馬魚 PD 模型中 ROS 生成的影響： 120 hpf 斑馬魚仔魚經(jīng) MPTP 處理熒光圖像顯示，與對照相比，ROS 生成增加。 然而，與 YIAEDAER 肽（2 μg/mL、10 μg/mL 和 50 μg/mL）共同處理會抑制 ROS 的產(chǎn)生。同對照與YIAEDAER肽（2?微克/毫升，（10?μg/mL）和（50?微克/毫升）聯(lián)合治療組以劑量依賴性方式顯著抑制ROS水平的強(qiáng)度相比，MPTP 組 ROS 水平的熒光強(qiáng)度顯著增加。
圖 6 在斑馬魚 PD 模型中YIAEDAER肽對 ROS 生成的作用。
YIAEDAER肽對自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響：簡單地說，自噬是負(fù)責(zé)清除受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的過程，與帕金森病有關(guān)。α-突觸核蛋白（α-syn）、e3泛素蛋白連接酶（parkin）、PTEN誘導(dǎo)的假定激酶1（pink1）、自噬相關(guān)基因5（atg5）、自噬相關(guān)基因7（atg7）、beclin1、ulk1b、ulk2、ambra1a已被確認(rèn)參與PD自噬的調(diào)節(jié)。為了研究 YIAEDAER 聯(lián)合治療通過調(diào)節(jié)自噬改善 MPTP 誘導(dǎo)的 PD 樣狀況，我們評估了這些基因的 mRNA 表達(dá)水平。parkin 或 pink1 的缺陷不僅會導(dǎo)致功能失調(diào)的線粒體的積累和 ROS 的釋放，而且還會導(dǎo)致 LBs 的積累，包括 α-syn。與對照組相比，MPTP組的α-syn轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，而YIAEDAER肽以濃度依賴性方式逆轉(zhuǎn)了這種增加。與對照組相比，MPTP給藥組的pink1和parkin mRNA表達(dá)顯著增加。與 2 μg/mL、10 μg/mL 和50 μg/mL的YIAEDAER 肽共處理后，pink1 的 mRNA 表達(dá)顯著降低。 然而，與 MPTP 組相比，小劑量(2 μg/mL) YIAEDAER 肽的聯(lián)合治療僅對 parkin 的 mRNA 表達(dá)產(chǎn)生抑制作用。然而，中、高劑量的YIAEDAER肽對parkin的mRNA表達(dá)沒有任何影響。與對照組相比，MPTP組atg5和atg7的mRNA表達(dá)水平顯著降低。
圖7、YIAEDAER肽治療后自噬相關(guān)基因的表達(dá)。
YIAEDAER肽對氧化應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響：氧化應(yīng)激在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的作用已得到充分證實(shí)。PD的特點(diǎn)是線粒體系統(tǒng)失調(diào)，表現(xiàn)為ROS的產(chǎn)生和隨后的釋放增加。為了了解 YIAEDAER 肽對 MPTP 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響，我們評估了幾個與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因的 mRNA 表達(dá)。MPTP治療組與對照組相比，sod1的mRNA表達(dá)水平無顯著差異。令人驚訝的是，與YIAEDAER肽的聯(lián)合治療 (2?μg/mL, 10?μg/mL, and 50?μg/mL)與MPTP組相比，sod1的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生任何顯著變化。與對照組相比， MPTP 處理組 sod2 和 gss 的 mRNA 表達(dá)水平顯著增加。 相反，與MPTP組相比，YIAEDAER肽(2 μg/mL)、(10 μg/mL)和(50 μg/mL)聯(lián)合治療組劑量依賴性地降低sod2的mRNA表達(dá)水平。此外，僅在中（10 μg/mL）和高（50 μg/mL）劑量的 YIAEDAER 肽中觀察到 gss 的 mRNA 表達(dá)水平顯著下降。
圖8、YIAEDAER肽治療后氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)。
討論：PD是一種無法治愈的神經(jīng)退行性疾病，其中α-syn在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的死亡和功能障礙中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。雖然PD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且不太清楚，但PD進(jìn)展期間DA神經(jīng)元的死亡與α-突觸核蛋白的異常聚集、氧化應(yīng)激的升高、線粒體功能的功能障礙以及神經(jīng)炎癥標(biāo)記物的上調(diào)有關(guān)。在探索阻止疾病進(jìn)展的新型抗PD治療策略的過程中，來自自然資源的化合物受到了越來越多的關(guān)注。在此，我們評估了 YIAEDAER 肽（2 μg/mL、10 μg/mL 和 50 μg/mL）在斑馬魚 MPTP 誘導(dǎo)的 PD 模型中的神經(jīng)保護(hù)作用，以及抗自噬和氧化應(yīng)激相關(guān)機(jī)制。 總的來說，我們發(fā)現(xiàn)YIAEDAER肽的抗PD作用與其濃度呈正相關(guān)，100 μg/mL的YIAEDAER肽顯示出最高的藥理活性。據(jù)報道，MPTP處理會對斑馬魚造成運(yùn)動障礙。為了證實(shí)MPTP的急性效應(yīng)，我們觀察到MPTP對斑馬魚的運(yùn)動損傷，其特征是總行程和平均游泳速度減少。YIAEDAER肽對MPTP誘導(dǎo)的運(yùn)動損傷具有改善作用，這一點(diǎn)通過總行程和游泳速度的增加而明顯。這種效應(yīng)在中濃度和高濃度下都很明顯。帕金森病的特點(diǎn)是除了運(yùn)動功能障礙外，還有一些非運(yùn)動癥狀，如反應(yīng)減退、癡呆和失眠，通常伴隨在運(yùn)動功能障礙階段。我們的研究測試了仔魚對刺激的反應(yīng)，以驗(yàn)證YIAEDAER改善PD樣非運(yùn)動癥狀的藥理活性。然而，當(dāng)前研究的局限性在于，反應(yīng)能力可能不是斑馬魚仔魚非運(yùn)動癥狀的唯一指標(biāo)，在進(jìn)一步研究中，可能會結(jié)合更多的測試，包括睡眠和記憶，來研究非運(yùn)動損傷活動。在嚙齒類動物或斑馬魚模型中，DA神經(jīng)元細(xì)胞的丟失或DA變性是PD的關(guān)鍵特征。任何可能的抗PD治療都應(yīng)該能夠改善PD腦內(nèi)進(jìn)行性DA神經(jīng)元變性。YIAEDAER肽聯(lián)合治療以濃度依賴性方式改善了MPTP給藥誘導(dǎo)的DA神經(jīng)元的丟失。因此，我們的發(fā)現(xiàn)為YIAEDAER肽可以拯救MPTP誘導(dǎo)的斑馬魚腦DA神經(jīng)元丟失的設(shè)想提供了證據(jù)。血腦屏障（BBB）是神經(jīng)與腦血管系統(tǒng)接口的重要組成部分。充足的血液供應(yīng)以及血管的結(jié)構(gòu)和功能完整性對大腦的正常功能至關(guān)重要，BBB功能障礙和腦血流量不足與包括PD在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。在目前的研究中，YIAEDAER肽聯(lián)合治療抑制了MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)元血管系統(tǒng)和腦血管的丟失。α-syn通過聚集、突變或過度表達(dá)蛋白的錯誤折疊對神經(jīng)元存活至關(guān)重要，α-syn失調(diào)可能會導(dǎo)致PD中的神經(jīng)退行性變和DA神經(jīng)元死亡。α-syn是一個14?kDa蛋白由140個氨基酸組成，在PD發(fā)病機(jī)制中已得到廣泛承認(rèn)，其聚集導(dǎo)致神經(jīng)退行性變和DA神經(jīng)元死亡。在斑馬魚PD的MPTP模型中，α-syn的轉(zhuǎn)錄水平增加。我們的研究結(jié)果反映了 MPTP 治療組中 α-syn 的表達(dá)增加，這反過來在用 YIAEDAER 肽治療后受到抑制，這反映了 YIAEDAER 肽抑制 α-syn 表達(dá)的潛力，使其成為可能的抗 PD 療法。自噬被認(rèn)為是一種重要的現(xiàn)象，細(xì)胞通過自噬去除受損的細(xì)胞器、錯誤折疊和異常聚集的蛋白質(zhì)來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。自噬與PD之間存在著令人信服的相關(guān)性，因?yàn)樽允稍谇宄奂腻e誤折疊蛋白質(zhì)和降解受損細(xì)胞器方面起著關(guān)鍵作用。Pink1和Parkin在PD自噬的分子調(diào)控中起到了關(guān)鍵作用。氧化應(yīng)激反映了活性氧的產(chǎn)生和抗氧化防御系統(tǒng)之間的不平衡，它可能與包括帕金森病在內(nèi)的幾種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展有關(guān)。PD動物模型中的ROS生成增加，這與我們觀察到的MPTP組ROS生成增加的情況類似。YIAEDAER 肽劑量依賴性地抑制 ROS 生成的強(qiáng)度，反映了其調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的潛力。 同樣，YIAEDAER 肽治療調(diào)節(jié)了幾個與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因（sod1、sod2、gss、gpx4a、gsto2 和 cat）的 mRNA 表達(dá)，表明其具有抗氧化應(yīng)激的潛力。
結(jié)論：綜上所述，目前的研究結(jié)果表明，YIAEDAER 肽主要通過抑制運(yùn)動障礙、改善 DA 神經(jīng)元的退化、抑制腦血管的損失來發(fā)揮抗 PD 活性。YIAEDAER肽潛在的抗PD作用可能是由于其在自噬和氧化應(yīng)激中的調(diào)節(jié)作用。因此，YIAEDAER肽可能是一種很有前途的抗帕金森病治療候選藥物.
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