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美鳳力臨床前大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心
17312606166
1995年，Tak Wah Mak 和 Arlene H. Sharpe 兩家實(shí)驗(yàn)室分別利用CTLA-4基因敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)了CTLA-4基因負(fù)調(diào)控T細(xì)胞活化的功能。
在活化的T細(xì)胞表面表達(dá)，與CD28（T細(xì)胞共激活因子）同源，兩者均可與抗原提呈細(xì)胞表面的CD80和CD86（也叫b7-1和b7-2）結(jié)合。CD28負(fù)責(zé)傳遞激活信號，活化T細(xì)胞；而CTLA-4負(fù)責(zé)傳遞抑制信號給T細(xì)胞，讓T細(xì)胞不會(huì)殺傷其它細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞。并且CTLA-4與CD80和CD86的親和力要高得多，因此會(huì)競爭和阻斷CD28的激活作用。
在靜息的幼稚T細(xì)胞中，CTLA-4主要位于胞內(nèi)，TCR和CD28：B7結(jié)合產(chǎn)生的刺激信號通過含有CTLA-4的囊泡的胞吐作用誘導(dǎo)CTLA-4異位到細(xì)胞表面。 通過CTLA-4：B7競爭結(jié)合產(chǎn)生負(fù)調(diào)控信號，通過抑制IL-2產(chǎn)生和細(xì)胞周期進(jìn)展來防止T細(xì)胞的完全活化。
CTLA-4-mediated inhibition of T cells. (圖片來自Am J Clin Oncol. 2016 Feb;39(1):98-106.)
CTLA-4還參與其它的免疫控制途徑。 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）組成型表達(dá)CTLA-4，CTLA-4 KO小鼠模型中Tregs控制效應(yīng)T細(xì)胞的功能被削弱，說明CTLA-4對Tregs功能也很重要。有研究認(rèn)為Tregs控制效應(yīng)T細(xì)胞的一種機(jī)制是APC上B7配體的下調(diào)，導(dǎo)致CD28共刺激減少。
CTLA-4-mediated inhibition of Tregs. (圖片來自Am J Clin Oncol. 2016 Feb;39(1):98-106.)
PD-1是共刺激受體B7 / CD28家族的成員，由PDCD1基因編碼，位于人2號染色體、小鼠1號染色體。
它通過與其配體程序性死亡配體1（PD-L1）和程序性死亡配體2（PD-L2）結(jié)合來調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化。與CTLA-4信號傳導(dǎo)類似，PD-1結(jié)合抑制T細(xì)胞增殖， 和干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子TNF-α和IL-2的產(chǎn)生，并降低T細(xì)胞存活率。PD-1及其配體是T細(xì)胞耗竭過程中最主要的抑制性受體。
PD-1-mediated inhibition of T cells. (圖片來自Am J Clin Oncol. 2016 Feb;39(1):98-106.)
在活化的T細(xì)胞表面表達(dá)
表達(dá)水平受tcr信號影響
降低T細(xì)胞的增殖、葡萄糖代謝、細(xì)胞因子產(chǎn)生和存活
| CTLA-4 | PD-1 |
| 在早期T細(xì)胞反應(yīng)（免疫致敏階段）起抑制作用，主要在淋巴組織 | 在T細(xì)胞反應(yīng)后期（免疫效應(yīng)階段）發(fā)揮作用，主要在外周組織 |
| 在T細(xì)胞表達(dá) | 除了T細(xì)胞以外，也在其它細(xì)胞中表達(dá)，如：B細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。 |
| 配體僅在抗原提呈細(xì)胞（APC）表達(dá) | 配體除了APC以外，也在其它免疫細(xì)胞中表達(dá)，如：PD-L1廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞，常見于造血細(xì)胞，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，以及非造血細(xì)胞，如血管和間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞，也在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。相較之下，PD-L2的表達(dá)受到很大的限制，主要由DC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞表達(dá)。 |
| 通過相較少途徑的T細(xì)胞信號通路發(fā)揮作用 | 通過更多途徑的T細(xì)胞信號通路發(fā)揮作用 |
| 影響Treg的功能 | 對Treg的作用尚不清楚 |
針對CTLA-4通路與PD-1/PD-L1通路的靶向藥物包括：
| 類型 | 名稱 | 公司 |
| CTLA-4 inhibitor | Ipilimumab | Bristol-Myers Squibb |
| Tremelimumab | Medimmune/Astrazeneca | |
| PD-1 inhibitor | Pembrolizumab | Merck |
Nivolumab | Bristol-Myers Squibb | |
| Pidilizumab | tionCureTech/Mediva | |
| PD-L1 inhibitor | Durvalumab | Medimmune/Astrazeneca |
| Atezolimab | Roche |
利用CTLA-4抗體和PD-1抗體分別阻斷CTLA-4和PD-1之后，抗PD-1主要誘導(dǎo)特定腫瘤浸潤的耗竭CD8 T細(xì)胞亞群的擴(kuò)增；抗CTLA-4在此基礎(chǔ)上還誘導(dǎo)了ICOS+ Th1-like CD4 T細(xì)胞擴(kuò)增。雖然它們都會(huì)使CD8+ T細(xì)胞增加，但其實(shí)是各自通過不同的細(xì)胞機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的：anti-PD-1主要是通過觸發(fā)線粒體氧化磷酸化途徑，而anti-CTLA-4則能觸發(fā)胞內(nèi)大多數(shù)信號途徑，其中還包括細(xì)胞周期調(diào)控途徑。
Anti-CTLA-4 and anti-PD-1 checkpoint- blockade therapies target distinct tumor- infiltrating T cell populations to induce tumor rejection.
盡管PD-1和CTLA-4靶向治療已經(jīng)能夠提高癌癥患者的平均預(yù)期壽命，但仍有諸多局限性。雖然CTLA-4抗體和PD-1抗體的聯(lián)合或順序療法正在火熱展開，但對于療效、用藥的持久性和副作用的研究都還剛剛起步，都凸顯出該領(lǐng)域進(jìn)一步創(chuàng)新的必要性。
構(gòu)建免疫檢驗(yàn)點(diǎn)人源化小鼠模型，使科研人員能夠研究只識(shí)別人體免疫檢驗(yàn)點(diǎn)的藥物。 人源化小鼠為研究靶定人體免疫檢驗(yàn)點(diǎn)的檢驗(yàn)點(diǎn)抑制劑提供了可能性，并且在臨床試驗(yàn)前更精準(zhǔn)的預(yù)測藥物功效以及可能的副作用（如自身免疫，促炎癥等）。
南模生物已開發(fā)出CTLA-4、PD-1、PD-L1三種已驗(yàn)證的人源化小鼠模型，用以測試靶向人體免疫檢驗(yàn)點(diǎn)的藥物。
CTLA4人源化小鼠構(gòu)建策略。在 C57BL/6J 遺傳背景下，將人源 CTLA4 蛋白編碼序列插入小鼠 Ctla4 基因的 ATG 位置，在表達(dá)全人源 CTLA4 蛋白的同時(shí)取代小鼠內(nèi)源 Ctla4 的表達(dá)。
FACS 檢測CTLA4 人源化小鼠活化后脾臟淋巴細(xì)胞的CTLA4 表達(dá)。CTLA4 人源化純合子小鼠脾臟淋巴細(xì)胞經(jīng)anti-CD3 和anti-CD28刺激 72h 后收集細(xì)胞染色，F(xiàn)ACS 檢測人源CTLA4 表達(dá)。結(jié)果顯示：CTLA4 人源化純合子小鼠活化的CD4+ 和CD8+ T 淋巴細(xì)胞中可以檢測到人源CTLA4 的活躍表達(dá)。（與CrownBio 合作完成）
· CTLA4人源化小鼠MC38荷瘤模型體內(nèi)驗(yàn)證結(jié)果
圖4. CTLA4人源化小鼠模型的抗CTLA4人源化抗體Ipilimumab 體內(nèi)抗腫瘤效果。 (數(shù)據(jù)為與信達(dá)生物制藥有限公司合作完成)
分組和給藥以及檢測：將MC38結(jié)直腸癌細(xì)胞接種于CTLA-4轉(zhuǎn)基因小鼠右側(cè)背部皮下，成瘤后隨機(jī)分為2組，然后分別給予Ipilimumab 10 mg/kg或者等體積生理鹽水進(jìn)行治療，每周給藥2次，連續(xù)給藥4次，每次給藥前測定腫瘤體積。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：抗human-CTLA4藥物Ipilimumab能夠顯著抑制MC38腫瘤在CTLA-4小鼠體內(nèi)的生長，給藥1周后即可檢測到腫瘤抑制效果，給藥2周后可見非常顯著的抑制效果（如上圖），同時(shí)Ipilimumab治療組有2只動(dòng)物腫瘤完全消失，而對照組則腫瘤持續(xù)生長。
圖5. CTLA4人源化小鼠模型的抗CTLA4人源化抗體Ipilimumab 體內(nèi)抗腫瘤效果。 (數(shù)據(jù)為與PharmaLegacy合作完成)
CTLA4 人源化小鼠 MC38 荷瘤模型體內(nèi)抗腫瘤藥效驗(yàn)證。CTLA4 人源化純合子小鼠接種 MC38 結(jié)腸癌細(xì)胞系，腫瘤生長至約 100 mm3隨機(jī)將動(dòng)物分組為對照組和治療組（n=9）。結(jié)果顯示： 針對人的 CTLA4 陽性藥物 Yervoy 有非常顯著的抗腫瘤效果（p<0.001），證明CTLA4 人源化小鼠是一個(gè)很好的驗(yàn)證針對人 CTLA4 抗體藥效的體內(nèi)模型。
PD-1人源化小鼠構(gòu)建策略。在 C57BL/6J 遺傳背景下，將人源 PDCD1 蛋白編碼區(qū)插入小鼠 Pdcd1 基因的 ATG 位置，在表達(dá)人源全長 PDCD1 蛋白的同時(shí)，取代小鼠內(nèi)源 Pdcd1 的表達(dá)。
· PD-1人源化小鼠T細(xì)胞流式分析（FACS）數(shù)據(jù)
PD-1人源化小鼠T細(xì)胞經(jīng)ConA激活后流式分析（與 Genscript 合作完成）。FACS 檢測 PD-1 人源化小鼠脾臟淋巴細(xì)胞 PD-1 表達(dá)。PD-1 人源化純合子小鼠和野生型小鼠取脾臟 T 淋巴細(xì)胞，體外 ConA 刺 激 24 小 時(shí) 后，F(xiàn)ACS 檢 測 人源 PD-1 在 T 細(xì)胞表面表達(dá)。結(jié)果顯示：ConA 體外刺激后，在 PD-1 人源化小鼠 T細(xì)胞表面可以檢測到人源 PD-1 蛋白表達(dá)。
· PD-1人源化小鼠MC38荷瘤模型體內(nèi)驗(yàn)證結(jié)果
A. 腫瘤組織平均體積±SEM。（與 Genscript 合作完成）
PD-1 人源化小鼠 MC38 荷瘤模型體內(nèi)抗腫瘤藥效驗(yàn)證。PD-1 人源化純合子小鼠接種 MC38 結(jié)腸癌細(xì)胞系，腫瘤生長至約 100 mm3隨機(jī)將動(dòng)物分組為對照組和治療組（n=8），每周給藥兩次，連續(xù)給藥四次。結(jié)果顯示：針對人的 PD-1 陽性藥物 Keytruda 有非常顯著的抗腫瘤效果（p<0.001），證明 PD-1 人源化小鼠是一個(gè)很好的驗(yàn)證針對人 PD-1 抗體藥效的體內(nèi)模型。
B. 腫瘤組織平均體積±SEM。C. 小鼠平均體重±SEM。 ( 與 PharmaLegacy 合作完成 )
PD-1 人源化小鼠MC38 荷瘤模型體內(nèi)抗腫瘤藥效劑量驗(yàn)證。PD-1 人源化純合子小鼠接種 MC38 結(jié)腸癌細(xì)胞系，腫瘤生長至約 90 mm3隨機(jī)將動(dòng)物分組為對照組和治療組（n=9）。結(jié)果顯示：針對人的 PD-1 抗體有非常顯著的抗腫瘤效果（p<0.001），且這種抗腫瘤效果呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)。
PD-L1人源化小鼠構(gòu)建策略。在 C57BL/6J 遺傳背景下，將人源 PD-L1 蛋白編碼序列插入小鼠 Pd-l1 基因的 ATG 位置，在表達(dá)全人源 PD-L1 蛋白的同時(shí)取代小鼠內(nèi)源 Pd-l1 的表達(dá)。
· PD-L1人源化小鼠T細(xì)胞流式分析（FACS）數(shù)據(jù)
FACS 檢測 PD-L1 人源化純合子小鼠和野生型小鼠脾臟淋巴細(xì)胞 PD-L1 表達(dá)。結(jié)果顯示：在人源化 PD-L1 純合子小鼠脾臟 T細(xì)胞和 B細(xì)胞中均可以檢測到人源PD-L1 的表達(dá)。（與 CrownBio 合作完成）
| 名稱 | 目錄號 | 狀態(tài) |
| CTLA-4-HU | NM-HU-00014 | 活體 |
| PD-1-HU | NM-HU-00015 | 活體 |
| PD-L1-HU | NM-HU-00062 | 活體 |
| PD-1&CTLA-4-HU | NM-HU-00079 | 活體 |
| PD-L1&CTLA-4-HU | NM-HU-00102 | 活體 |
| PD-1&PD-L1-HU | NM-HU-00100 | 活體 |
Egen JG, Kuhns MS, Allison JP. CTLA-4: new insights into its biological function and use in tumor immunotherapy. Nat Immunol. 2002;3:611–618.Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD. The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting. Immunity. 2004;21:137–148.Parry RV, Chemnitz JM, Frauwirth KA, et al. CTLA-4 and PD-1 receptors inhibit T-cell activation by distinct mechanisms. Mol Cell Biol. 2005;25:9543–9553.Wing K, Onishi Y, Prieto-Martin P, et al. CTLA-4 control over Foxp3+ regulatory T cell function. Science. 2008;322:271–275.Chen DS, Irving BA, Hodi FS. Molecular pathways: next-generation immunotherapy—inhibiting programmed death-ligand 1 and programmed death-1. Clin Cancer Res. 2012;18:6580–6587.Buchbinder EI, Desai A. CTLA-4 and PD-1 Pathways: Similarities, Differences, and Implications of Their Inhibition. Am J Clin Oncol. 2016 Feb;39(1):98-106.
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