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摘要：慢性疾病和造血障礙與炎癥小體的失調(diào)有關(guān)。我們小組最近報(bào)道了炎癥小體在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞分化中的相關(guān)性。然而，骨髓細(xì)胞炎癥小體在造血調(diào)節(jié)中的影響在很大程度上是未知的。在這項(xiàng)研究中，我們利用斑馬魚模型的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)證明，對(duì)巨噬細(xì)胞炎性體的遺傳抑制導(dǎo)致皮膚炎癥仔魚中巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，而不影響紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。同樣，通過相同的策略抑制中性粒細(xì)胞炎性體，導(dǎo)致皮膚炎癥仔魚中中性粒細(xì)胞數(shù)量增加，但不影響紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在這個(gè)模型中，中性粒細(xì)胞炎癥小體的過度激活促進(jìn)了中性粒細(xì)胞的死亡，可以通過藥物抑制Gasdermin E來恢復(fù)。得出結(jié)論，骨髓炎性體通過斑馬魚中的 Gasdermin E 依賴性途徑自主調(diào)節(jié)慢性炎癥中的細(xì)胞焦亡。

關(guān)鍵詞：炎癥  細(xì)胞焦亡  造血  髓細(xì)胞  Asc  Gbp4  Caspase-1 

簡(jiǎn)介：炎癥小體是一組多蛋白復(fù)合物，通過模式識(shí)別受體（PPR）檢測(cè)損傷相關(guān)分子模式（DAMP）和病原體相關(guān)分子模式（PAMP），通過 Gasdermin D 和 Caspase-1、-4、-5、-11 介導(dǎo)類花生酸產(chǎn)生、促炎細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞焦亡來調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)。慢性炎癥、造血障礙和衰老與炎癥小體的失調(diào)有關(guān)。NLRP3 炎癥小體的失調(diào)與多種慢性疾病有關(guān)，例如動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和阿爾茨海默病。然而，炎癥小體也可能在自身免疫性疾病和癌癥中具有保護(hù)作用。在炎癥期間，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被激活并被募集到炎癥的組織中。 中性粒細(xì)胞是人體中最豐富的循環(huán)白細(xì)胞，在急性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，因?yàn)樗鼈儽谎杆偌せ畈⑹紫鹊竭_(dá)炎癥部位。巨噬細(xì)胞是由活化的循環(huán)單核細(xì)胞產(chǎn)生的，這些單核細(xì)胞離開血液滲入組織并極化成兩種表型：增強(qiáng)炎癥的 M1 或促進(jìn)組織修復(fù)的 M2。兩種免疫細(xì)胞都與適應(yīng)性免疫細(xì)胞合作，在炎癥和消退之間取得平衡。 一旦危險(xiǎn)信號(hào)消失，巨噬細(xì)胞就會(huì)吞噬死亡的中性粒細(xì)胞和其他死亡細(xì)胞，以恢復(fù)體內(nèi)平衡。 然而，當(dāng)缺乏協(xié)調(diào)時(shí)，就會(huì)發(fā)生免疫紊亂。典型的斑馬魚炎癥體由三種通過同型相互作用的成分組成：傳感器、適配器蛋白和酶原形式的效應(yīng)器半胱天冬酶。鳥苷酸結(jié)合蛋白 (Gbps) 也是斑馬魚炎癥小體的一部分，例如需要 Asc 才能發(fā)揮活性的 Gbp4。我們利用斑馬魚模型的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)進(jìn)行體內(nèi)成像以及化學(xué)和遺傳操作，以闡明慢性皮膚炎癥模型中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中組織特異性炎性體抑制的后果。

抑制巨噬細(xì)胞炎癥小體導(dǎo)致斑馬魚皮膚炎癥的巨噬細(xì)胞數(shù)量增加：為了研究炎癥期間巨噬細(xì)胞中炎癥小體的特異性抑制作用，我們使用T（mpeg1:Gal4.VP16）和Tg（UAS:AscΔCARD-GFP）表達(dá)巨噬細(xì)胞中炎癥小體適配器Asc的顯性陰性形式，然后使用CRISPR-Cas9對(duì)spint1a進(jìn)行遺傳抑制以誘導(dǎo)皮膚炎癥。在Spint1a敲除的仔魚中發(fā)現(xiàn)了巨噬細(xì)胞數(shù)量增加以應(yīng)對(duì)炎癥，中性粒細(xì)胞也是如此。

圖 1. 抑制巨噬細(xì)胞炎癥小體導(dǎo)致斑馬魚皮膚炎癥的巨噬細(xì)胞數(shù)量增加。(A) 用于抑制巨噬細(xì)胞炎性體的斑馬魚系示意圖。使用 綠色熒光心臟標(biāo)記Tg (uas:ascΔCARD-GFP)篩選后代。（B，C）用對(duì)照或 spint1a crRNA/Cas9 復(fù)合物顯微注射單細(xì)胞期斑馬魚卵。在3dpf時(shí)，巨噬細(xì)胞（B）、中性粒細(xì)胞（C）和紅細(xì)胞（D）分別用中性紅、蘇丹黑和鄰二苯胺染色。

使用類似的遺傳策略抑制整個(gè)仔魚和造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞 (HSPCs) 中的炎性體導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，然后分析了巨噬細(xì)胞炎性體抑制對(duì)紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量的影響，發(fā)現(xiàn)兩者不受影響。

中性粒細(xì)胞炎癥小體的抑制導(dǎo)致斑馬魚皮膚炎癥的中性粒細(xì)胞數(shù)量增加：我們進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)，以分析抑制中性粒細(xì)胞炎癥小體對(duì)對(duì)照組和炎癥仔魚的影響。在 Tg(mpx:Gal4.VP16) 和Tg(UAS:AscΔCARD-GFP) 系使用髓過氧化物酶啟動(dòng)子 (mpx) 在中性粒細(xì)胞中表達(dá)顯性陰性 Asc。結(jié)果表明，抑制中性粒細(xì)胞炎性體加重了Spint1a敲除仔魚的中性粒細(xì)胞感染。然而，通過血紅蛋白染色檢測(cè)的紅細(xì)胞生成沒有受到影響。

圖 2. 中性粒細(xì)胞炎癥小體的抑制導(dǎo)致斑馬魚皮膚炎癥的中性粒細(xì)胞數(shù)量增加。(A) 用于抑制中性粒細(xì)胞炎性體的斑馬魚系示意圖。使用綠色熒光心臟標(biāo)記 Tg (uas:ascΔCARD-GFP)篩選后代。（B，C）用對(duì)照或 spint1a crRNA/Cas9 復(fù)合物顯微注射單細(xì)胞期斑馬魚卵。在 3 dpf 時(shí)，中性粒細(xì)胞 (B) 和紅細(xì)胞 (C) 分別用中性紅、蘇丹黑和鄰二苯胺染色。

為了進(jìn)一步證實(shí)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞炎性體在炎癥過程中的細(xì)胞自主作用，使用 Tg(runx1:Gal4.VP16) 和 Tg(UAS:AscΔCARD-GFP) 系抑制了造血祖細(xì)胞和干細(xì)胞 (HPSC) 中的炎性體。正如預(yù)期的那樣，抑制 HSPCs 中的炎性體導(dǎo)致對(duì)照仔魚中的中性粒細(xì)胞數(shù)量減少，證實(shí)了先前的結(jié)果。相比之下，炎癥繞過了抑制 HSPC 炎性體對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響，證實(shí)了在炎癥的仔魚中觀察到的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞炎性體的細(xì)胞自主作用。

圖 3. HSPC 炎性體的抑制不會(huì)影響斑馬魚皮膚炎癥的中性粒細(xì)胞數(shù)量。(A) 示意圖顯示了用于抑制 HSPCs 炎性體的斑馬魚系。使用熒光綠色心臟標(biāo)記 Tg (uas:ascΔCARD-GFP)對(duì)后代進(jìn)行篩選。(B) 用對(duì)照或 spint1a crRNA/Cas9 復(fù)合物顯微注射單細(xì)胞期斑馬魚卵。 在 3 dpf 時(shí)中性粒細(xì)胞被蘇丹黑染色。

中性粒細(xì)胞炎性體的激活通過皮膚炎癥斑馬魚中的gasdermin E促進(jìn)中性粒細(xì)胞的焦亡：進(jìn)一步證實(shí)中性粒細(xì)胞炎性體在炎癥反應(yīng)期間調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在中性粒細(xì)胞炎癥小體激活后，患有皮膚炎癥的斑馬魚幼體中中性粒細(xì)胞的數(shù)量減少，而對(duì)照組幼體中中性粒細(xì)胞的數(shù)量沒有減少。迄今為止的結(jié)果表明中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞炎癥小體的細(xì)胞自主效應(yīng)，我們接下來分析了是否只在炎癥的仔魚中激活了骨髓細(xì)胞中的焦亡。TUNEL 分析顯示 Spint1a 敲除仔魚中的死細(xì)胞數(shù)量高于其野生型同胞。此外，Spint1a敲除仔魚皮膚中的lyz+/TUNEL+細(xì)胞（即死亡的中性粒細(xì)胞）急劇增加，但在CHT中沒有。值得注意的是，Spint1a敲除仔魚中性粒細(xì)胞炎性體的激活導(dǎo)致皮膚中TUNEL+中性粒細(xì)胞的數(shù)量增加，而CHT的中性粒細(xì)胞數(shù)量沒有改變。

圖 4. 中性粒細(xì)胞炎癥小體的激活促進(jìn)斑馬魚皮膚炎癥的中性粒細(xì)胞焦亡。我們分別使用gasdermin Ea和Gsdmeb抑制劑Ac-CMK-SEVD和Ac-CMK-FEID進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞焦亡參與炎癥仔魚的中性粒細(xì)胞死亡和所涉及的gasdermin，因?yàn)榘唏R魚缺乏Gsdmd和Gsdme，其已被證明介導(dǎo)該物種的細(xì)胞焦亡。結(jié)果表明，兩種肽抑制劑都挽救了具有過度活躍的中性粒細(xì)胞炎性體的 Spint1a 敲除仔魚中的中性粒細(xì)胞數(shù)量。

圖 5. Gsdme 介導(dǎo)皮膚炎癥斑馬魚中性粒細(xì)胞焦亡。

討論：盡管炎癥小體與健康和疾病相關(guān)，但它對(duì)造血的調(diào)節(jié)作用卻很少受到關(guān)注。我們假設(shè)炎癥損傷（例如皮膚炎癥）激活中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的炎癥小體可能對(duì)造血產(chǎn)生影響，因?yàn)樵谘装Y性疾病中通常出現(xiàn)造血譜系偏差，并導(dǎo)致中性粒細(xì)胞增多和貧血。出人意料的是，在斑馬魚皮膚炎癥模型中，我們沒有發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞炎性體調(diào)節(jié)造血的證據(jù)，這表明造血的改變可以通過抑制典型炎性體來緩解。雖然這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了炎癥小體在HSPC的髓系-紅系譜系決定中的關(guān)鍵相關(guān)性，我們不能排除成熟骨髓細(xì)胞中炎癥小體的激活也可能參與其他實(shí)驗(yàn)條件下的造血調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致通常與慢性疾病相關(guān)的中性粒細(xì)胞增多和貧血。我們的結(jié)果顯示，在炎癥小體基因失活后，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量增加，炎癥小體以細(xì)胞自主方式起作用，而基因激活則產(chǎn)生相反的效果。TUNEL 分析以及抑制斑馬魚 Gsdme 的兩個(gè)旁系同源物表明，皮膚炎癥仔魚中骨髓炎性體的激活導(dǎo)致 Gsdme 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。值得注意的是，僅在患有皮膚炎癥的斑馬魚仔魚中觀察到中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞焦亡，這表明炎癥損傷對(duì)于激活這些細(xì)胞中的炎性體是絕對(duì)必要的。值得在未來的研究中研究由炎癥的角質(zhì)形成細(xì)胞釋放的炎癥損傷，這是誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬因細(xì)胞焦亡而死亡所必需的。

圖 6. 顯示 Gsdme 介導(dǎo)的慢性炎癥期間巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞細(xì)胞焦亡的工作模型。在慢性炎癥期間，來自炎癥組織的炎癥信號(hào)到達(dá)造血組織并促進(jìn) HSPCs 分化為巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。A) 中性粒細(xì)胞通過炎癥信號(hào)梯度被募集到炎癥的組織中，在那里它們發(fā)揮功能并因細(xì)胞焦亡而死亡，從而調(diào)節(jié)炎癥所需的中性粒細(xì)胞數(shù)量。B) 通過強(qiáng)制表達(dá) DN-Asc 抑制中性粒細(xì)胞炎性體會(huì)損害細(xì)胞焦亡并導(dǎo)致中性粒細(xì)胞在炎癥組織中的積累。C) 通過強(qiáng)制表達(dá) Gbp4 激活中性粒細(xì)胞炎性體進(jìn)一步促進(jìn)浸潤(rùn)在炎癥皮膚中的中性粒細(xì)胞的焦亡，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞清除。在巨噬細(xì)胞中也有類似的機(jī)制。盡管在伴有皮膚炎癥的仔魚的巨噬細(xì)胞中會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，但在中性粒細(xì)胞中卻沒有。 因此，焦亡在中性粒細(xì)胞生物學(xué)中的相關(guān)性是非常有爭(zhēng)議的。例如，據(jù)報(bào)道小鼠中性粒細(xì)胞具有獨(dú)特的炎性體，不會(huì)引發(fā)細(xì)胞焦亡，并允許這些細(xì)胞在急性沙門氏菌感染期間維持 IL-1β 釋放。與之形成鮮明對(duì)比的是，在銅綠假單胞菌肺部感染的小鼠中報(bào)告了中性粒細(xì)胞焦亡。同樣，缺乏GSDMD的小鼠表現(xiàn)出中性粒細(xì)胞延遲死亡和增強(qiáng)宿主對(duì)細(xì)胞外大腸桿菌的防御能力。

總之，我們證明中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞炎癥小體通過 Gdsme 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡機(jī)制在慢性皮膚炎癥斑馬魚模型中以細(xì)胞自主方式調(diào)節(jié)它們的數(shù)量。然而，我們沒有發(fā)現(xiàn)在慢性皮膚炎癥期間通過激活中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞炎癥小體來調(diào)節(jié)造血功能的證據(jù)。

原文出自：Gasdermin E mediates pyroptotic cell death of neutrophils and macrophages in a zebrafish model of chronic skin inflammation - ScienceDirect