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美鳳力臨床前大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心
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摘要：斑馬魚是模擬人類疾病的重要?jiǎng)游锵到y(tǒng)。 這包括腎功能障礙，因?yàn)榕咛ツI（前腎）與人類腎單位在分子和形態(tài)方面同源性高。腎病的一個(gè)關(guān)鍵臨床指標(biāo)是蛋白尿，但目前缺乏斑馬魚蛋白尿的高通量判讀。為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們使用Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)生成了轉(zhuǎn)基因斑馬魚系，該系使用fabp10a肝特異性啟動(dòng)子過(guò)度表達(dá)與受體相關(guān)蛋白D3結(jié)構(gòu)域融合的納米熒光素酶分子（一種分子伴侶），我們稱之為NL-D3，我們通過(guò)測(cè)量胚胎培養(yǎng)基中的發(fā)光強(qiáng)度來(lái)定量NL-D3斑馬魚仔魚的蛋白尿。使用光度計(jì)，通過(guò)測(cè)量胚胎培養(yǎng)基中的發(fā)光強(qiáng)度來(lái)量化 NL-D3 斑馬魚仔魚中的蛋白尿。在健康狀態(tài)下，NL-D3 不會(huì)被排出，但是當(dāng)用影響近端腎小管重吸收（順鉑、慶大霉素）或腎小球?yàn)V過(guò)（血管緊張素 II、漢克斯平衡鹽溶液、牛血清白蛋白）的化學(xué)物質(zhì)處理胚胎時(shí)，在魚培養(yǎng)基中檢測(cè)到NL-D3。類似地，與腎臟疾病相關(guān)的幾種基因產(chǎn)物（nphs1、nphs2、lrp2a、ocrl、col4a3和col4a4）的缺失也誘導(dǎo)了NL-D3蛋白尿。用卡托普利治療缺乏col4a4的斑馬魚仔魚（Alport綜合征模型）可減少蛋白尿。研究結(jié)果證實(shí)了NL-D3轉(zhuǎn)基因斑馬魚作為一種穩(wěn)健和可量化的蛋白尿報(bào)告品系的使用。鑒于斑馬魚高通量檢測(cè)的可行性，NL-D3轉(zhuǎn)基因斑馬魚將允許篩選改善蛋白尿的藥物，從而優(yōu)先考慮進(jìn)一步轉(zhuǎn)化研究的候選藥物。
關(guān)鍵詞：Alport綜合征 基底膜 腎小球 蛋白尿 近端小管 IV型膠原 斑馬魚
蛋白尿是腎臟疾病的重要臨床指標(biāo)。 使用尿液試紙，可以在幾秒鐘內(nèi)確定尿液中是否存在蛋白質(zhì)。對(duì)尿液中蛋白質(zhì)分子大小的進(jìn)一步評(píng)估表明腎單位功能缺陷的位置。尿液中大蛋白的存在表明腎小球?yàn)V過(guò)器功能紊亂，而低分子量蛋白的存在則表明近端小管功能紊亂。斑馬魚是研究腎臟發(fā)育和疾病的流行模式生物，但目前缺乏蛋白尿的定量報(bào)告。胚胎斑馬魚發(fā)育出一個(gè)功能正常的前腎，其分子和結(jié)構(gòu)與人類腎單位相似。前腎由單個(gè)中線融合腎小球組成，附著于雙側(cè)小管，沿其前后軸分割為不同的近端和遠(yuǎn)端區(qū)域。測(cè)定斑馬魚胚胎腎功能的最佳方法是使用不同分子量的熒光右旋糖酐來(lái)區(qū)分腎小球和近端小管功能障礙。熒光右旋糖酐對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)吞的細(xì)胞機(jī)制沒(méi)有特異性；這些方法是有用的，但它們不是定量的，且不能以高通量方式使用，不能特異性識(shí)別近端小管中巨蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞缺陷。斑馬魚轉(zhuǎn)基因報(bào)告基因品系(fabp10a:?vdbp-mCherry) 使胚胎培養(yǎng)基能夠被收集并檢測(cè)低分子量蛋白質(zhì)。這一功能強(qiáng)大的系統(tǒng)允許定量蛋白尿作為近端小管中l(wèi)rp2/巨蛋白內(nèi)吞途徑功能障礙的判讀。通過(guò)免疫熒光成像或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，報(bào)告近端小管功能障礙，以量化近端小管中的蛋白攝取和蛋白尿。這種遺傳工具突出了轉(zhuǎn)基因在斑馬魚中開(kāi)發(fā)蛋白尿報(bào)告基因的潛力。我們描述了一種新的基于納米熒光素酶（NL）的斑馬魚蛋白尿報(bào)告基因。胚胎培養(yǎng)基中排泄的NL蛋白在添加其底物熒光素后通過(guò)發(fā)光檢測(cè)。利用這一新系統(tǒng)可以高通量方式測(cè)定近端腎小管和腎小球功能的變化。
體外重組 NL-D3 可被內(nèi)吞：目的是開(kāi)發(fā)一種轉(zhuǎn)基因報(bào)告基因來(lái)研究斑馬魚前腎近端小管的內(nèi)吞作用。近端小管內(nèi)吞途徑的一個(gè)重要組成部分是具有多個(gè)配體的600 kDa巨蛋白受體。巨蛋白的功能和加工依賴于受體相關(guān)蛋白，該蛋白包含與巨蛋白具有不同親和力的三維結(jié)構(gòu)域。我們將大鼠受體相關(guān)蛋白與NL融合。全長(zhǎng)受體相關(guān)蛋白-NL融合產(chǎn)生大小為58kDa的蛋白。假設(shè)限制報(bào)告蛋白的大小有助于其通過(guò)腎小球毛細(xì)血管壁，因此我們將受體相關(guān)蛋白的14 kDa D3結(jié)構(gòu)域融合到NL的C端，以產(chǎn)生NL-D3，其預(yù)測(cè)大小為35.5 kDa。我們首先想確認(rèn) NL-D3 融合蛋白可以報(bào)告巨蛋白依賴性內(nèi)吞作用。在大腸桿菌中表達(dá)重組 NL-D3，并分離純化蛋白質(zhì)。然后將重組NL-D3用于HEK293細(xì)胞的攝取實(shí)驗(yàn)，該細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)截短的megalin。通過(guò)裂解細(xì)胞并測(cè)量發(fā)光來(lái)測(cè)量攝取，與用重組NL-D3孵育的對(duì)照HEK293細(xì)胞相比，用重組NL3-D3培養(yǎng)的HEK293-MmR4細(xì)胞具有大約10倍高的攝取水平。對(duì)照HEK293細(xì)胞和HEK293-MmR4細(xì)胞在與NL孵育后均未顯示發(fā)光。這些體外結(jié)果表明 NL-D3 與巨蛋白結(jié)合并容易被內(nèi)吞。
圖1. NL-D3被巨蛋白內(nèi)吞途徑攝取。
γ-crystallin:mcherry/fabp10a:NL-D3斑馬魚：為了開(kāi)發(fā)一種可行的近端小管內(nèi)吞作用的體內(nèi)報(bào)告者，我們轉(zhuǎn)向斑馬魚模型。使用多功能 Tol2 基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)生成轉(zhuǎn)基因斑馬魚，在肝臟特異性 fabp10a 啟動(dòng)子的控制下表達(dá) NL-D3。為了進(jìn)行選擇，轉(zhuǎn)座因子在γ-晶體蛋白啟動(dòng)子的控制下雙重表達(dá)McHery。5-dpf的轉(zhuǎn)基因的γ-crystallin:mcherry/fabp10a:NL-D3斑馬魚（下文稱為NL-D3）的全胚胎裂解物的發(fā)光比野生型胚胎高約100000倍。成年期NL-D3報(bào)告魚分離的血液中觀察到類似的發(fā)光增加。還測(cè)量了成年期器官組織中NL-D3的含量，肝臟的發(fā)光最多。轉(zhuǎn)基因斑馬魚中NL-D3的肝臟特異性表達(dá)導(dǎo)致該報(bào)告物強(qiáng)烈釋放到血管系統(tǒng)中。培育了多代NL-D3轉(zhuǎn)基因斑馬魚，沒(méi)有觀察到對(duì)魚類整體健康或壽命的任何影響。NL-D3斑馬魚和年齡匹配對(duì)照組肝臟的組織學(xué)分析顯示無(wú)明顯變化。
NL-D3 胚胎檢測(cè)近端小管功能障礙：為了測(cè)試 NL-D3 是否通過(guò)腎小球?yàn)V器并被前腎近端小管中的巨蛋白內(nèi)吞途徑重吸收。近端小管對(duì)10 kDa熒光右旋糖酐的再攝取評(píng)分為正常、低或無(wú)。與對(duì)照組（n=40）相比，lrp2a的缺失足以嚴(yán)重減少近端小管中10 kDa熒光右旋糖酐的攝?。╪=39）。將4 dpf的lrp2a變體置于96孔板的1孔中，更換胚胎培養(yǎng)基，用光度計(jì)測(cè)量胚胎培養(yǎng)基中的NL-D3含量。與每孔 1 個(gè)胚胎相比，每孔 3 個(gè)胚胎（n = 9孔）在發(fā)光測(cè)量中產(chǎn)生的變異性較小。還測(cè)量了1小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)和24小時(shí)取自lrp2a變體的胚胎培養(yǎng)基的發(fā)光（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=9）。NL-D3 報(bào)告基因的靈敏度足以在短短 1 小時(shí)后評(píng)估蛋白尿，但對(duì)照和實(shí)驗(yàn)樣品之間的分離在 24 小時(shí)時(shí)最大。我們?cè)谒械姆治鲋卸际褂昧诉@個(gè)時(shí)間點(diǎn)。使用重組NL-D3生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將從光度計(jì)獲得的相對(duì)發(fā)光單位定量轉(zhuǎn)換為NL-D3量（ng/ml）。lrp2a的缺失導(dǎo)致胚胎培養(yǎng)基中存在的NL-D3增加約29倍。另一種與近端小管內(nèi)吞作用有關(guān)的基因產(chǎn)物是OCRL，致病性變體導(dǎo)致Lowe綜合征，與低分子量蛋白尿相關(guān)。我們還測(cè)試了靶向近端小管并誘導(dǎo)蛋白尿的腎毒素的作用。慶大霉素和順鉑是 2 種公認(rèn)的腎毒素藥物，主要通過(guò)近端小管細(xì)胞死亡引起腎臟損傷，以前曾用于消融斑馬魚近端小管上皮。胚胎培養(yǎng)基中 NL-D3 分泌的分析表明，與賦形劑對(duì)照相比，0.5 nl 6 ng/μl 慶大霉素使蛋白尿增加約 13 倍。用雙倍量的慶大霉素處理胚胎使蛋白尿進(jìn)一步增加至對(duì)照（n = 12）的約 534 倍，表明在 NL-D3 報(bào)告基因中可檢測(cè)到劑量反應(yīng)。順鉑也獲得了類似的劑量反應(yīng)，低劑量（0.5mM）導(dǎo)致蛋白尿增加約1.5倍，高劑量（1.5mM）引起約6.7倍。這些結(jié)果證實(shí)了NL-D3轉(zhuǎn)基因魚是一種可行的工具，用于檢測(cè)近端腎小管功能障礙引起的蛋白尿。
圖 2. NL-D3 斑馬魚可用于檢測(cè)近端小管功能障礙。
NL-D3胚胎檢測(cè)腎小球功能障礙：我們進(jìn)一步分析了干擾腎小球特異性基因表達(dá)的影響，以確定 NL-D3 報(bào)告基因是否也可用于測(cè)量與腎小球功能障礙相關(guān)的蛋白尿。NPHS1 和 NPHS2 編碼建立足細(xì)胞裂孔隔膜的蛋白質(zhì)。這些基因的致病性變異導(dǎo)致腎病綜合征，其特征是蛋白尿過(guò)多。使用與 Fukuyo 等人使用的相同的嗎啉代寡核苷酸，我們觀察到 500 kDa 異硫氰酸熒光素綴合的葡聚糖從脈管系統(tǒng)中清除，證實(shí)嗎啉代會(huì)導(dǎo)致腎小球功能障礙。這些結(jié)果表明，NL-D3報(bào)告基因作為腎小球和近端腎小管功能障礙的雙重報(bào)告基因。對(duì)斑馬魚前腎腎小球發(fā)育的透射電子顯微鏡分析表明，在大約 4 dpf 時(shí)建立了完全形成的過(guò)濾屏障。前腎小管的分化早于此，受精后48小時(shí)出現(xiàn)刷狀邊緣和近端-遠(yuǎn)端分割。測(cè)試了NL-D3報(bào)告基因是否可以在早期發(fā)育階段用于檢測(cè)與近端小管功能障礙或腎小球功能障礙相關(guān)的蛋白尿。發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組（n=20）、nphs1變體（n=16）、lrp2a變體（n=12）或ocrl變體中，在24和48 hpf之間的報(bào)告者中均未檢測(cè)到腎小管或腎小球相關(guān)蛋白尿。
圖3.NL-D3斑馬魚也可用于研究腎小球疾病。
斑馬魚colIV基因的表達(dá)分析：鑒于與腎小球病理相關(guān)的腎臟疾病過(guò)多，NL-D3斑馬魚系測(cè)量腎小球功能障礙的潛力令人感興趣。其中一種情況是阿爾波特綜合征，由人類COL4A3、COL4A4或COL4A5的變異引起。COL4A3、COL4A4或COL4A5的變體導(dǎo)致GBM中膠原a3a4a5（IV）減少或缺失，影響其長(zhǎng)期功能。阿爾波特綜合征患者最初出現(xiàn)微量血尿，隨后出現(xiàn)蛋白尿，腎功能逐漸下降，導(dǎo)致腎衰竭。斑馬魚腎小球中 IV 型膠原蛋白鏈的表達(dá)譜以前沒(méi)有被表征過(guò)。 斑馬魚有 6 個(gè) IV 型膠原基因 col4a1-a6，它們是人類中發(fā)現(xiàn)的 6 個(gè) IV 型膠原基因 (COL4A1-A6) 的直系同源物。進(jìn)行了原位雜交以檢測(cè)4dpf斑馬魚胚胎中col4a1–a6轉(zhuǎn)錄物的空間組織，這是腎小球完全發(fā)育的時(shí)間點(diǎn)。預(yù)期col4a1和col4a2的表達(dá)譜是相同的，因?yàn)榧棺祫?dòng)物IV型膠原基因的表達(dá)是通過(guò)col4a1/col4a2、col4a3/COL4B4和COL4B5/COL4S6的假定雙向啟動(dòng)子調(diào)控的。在血管系統(tǒng)中檢測(cè)到 col4a1 和 col4a2 轉(zhuǎn)錄物，最顯著的是在主動(dòng)脈弓、中央動(dòng)脈和頭部區(qū)域的原始后腦通道中。在橫切胚胎中清楚地觀察到 col4a1 的腎小球定位。與 col4a1 和 col4a2 相比，col4a3 和 col4a4 表達(dá)譜受到更多限制。在晶狀體囊和腎小球中觀察到col4a3和col4a4的高水平表達(dá)，在鰓弓中檢測(cè)到弱表達(dá)。使用原位雜交，我們無(wú)法檢測(cè)腎小球中col4a5的表達(dá)，盡管使用了不同的探針。
圖4. 斑馬魚腎小球中表達(dá)IV型膠原
鑒于斑馬魚 NL-D3 轉(zhuǎn)基因報(bào)告系可用于檢測(cè)腎小球功能障礙，其中蛋白尿是關(guān)鍵臨床特征，例如在 Alport 綜合征中，我們接下來(lái)嘗試使用化學(xué)方法挽救腎小球?yàn)V過(guò)以確定該系統(tǒng)用于復(fù)合篩選的潛力。col4a4 crispants被用作阿爾波特綜合征的模型。對(duì)3 dpf至5 dpf的col4a4 crispants施用卡托普利來(lái)降低全身血壓，我們測(cè)定了4 dpf至5dpf的蛋白尿。卡托普利是一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，以前曾用于斑馬魚以降低血壓。假設(shè)降低全身血壓也會(huì)降低腎小球內(nèi)壓。我們發(fā)現(xiàn)卡托普利治療對(duì)未注射的斑馬魚胚胎沒(méi)有影響，但幾乎完全防止了col4a4 crispants的蛋白尿。使用2,3-丁二酮2-單肟降低3 dpf至5 dpf斑馬魚胚胎的心率。假設(shè)較低的心率會(huì)導(dǎo)致腎小球灌注減少，從而減少腎小球?yàn)V過(guò)。野生型斑馬魚胚胎劑量反應(yīng)分析表明，濃度為7.5μM的2,3-丁二酮2-單肟足以顯著降低心率。血管緊張素 II 是一種肽激素，可通過(guò)誘導(dǎo)血管收縮來(lái)增加血壓。發(fā)現(xiàn) 0.5 μM 血管緊張素 II 不會(huì)導(dǎo)致 NL-D3 胚胎出現(xiàn)蛋白尿； 然而，5 μM 血管緊張素 II 導(dǎo)致蛋白尿增加約 3.4 倍（n = 12）。注射 Hanks 平衡鹽溶液或 10% 牛血清白蛋白會(huì)導(dǎo)致 NL-D3 報(bào)告胚胎中的蛋白尿急劇增加。漢克斯平衡鹽溶液是一種鹽水溶液，注射時(shí)會(huì)導(dǎo)致水流入血管系統(tǒng)，并已被證明會(huì)擴(kuò)張腎小球毛細(xì)血管。假設(shè)注射 Hanks 平衡鹽溶液會(huì)在腎小球中產(chǎn)生急性機(jī)械負(fù)荷從而導(dǎo)致蛋白尿。，我們觀察到 500 kDa 熒光素異硫氰酸酯共軛葡聚糖的清除率增加支持這一點(diǎn)。我們檢測(cè)到Hanks平衡鹽溶液注射的 NL-D3 胚胎發(fā)光增加了大約 128 倍。這些數(shù)據(jù)證實(shí)NL-D3報(bào)告系可以檢測(cè)與全身血壓和腎小球灌注變化相關(guān)的蛋白尿。他們還強(qiáng)調(diào)了這一新工具在腎功能治療篩查中的潛力。
結(jié)論：我們的數(shù)據(jù)顯示了基于 NL 的斑馬魚品系蛋白尿報(bào)告基因的開(kāi)發(fā)。 鑒于該系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)可用性和高通量篩選的可行性方面的優(yōu)勢(shì)，預(yù)計(jì)這種新的蛋白尿報(bào)告基因?qū)⒊蔀槟I臟研究人員工具包的寶貴補(bǔ)充。
原文出自：A novel nanoluciferase transgenic reporter measures proteinuria in zebrafish - ScienceDirect
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