TEL:17312606166（魏經(jīng)理）
美鳳力臨床前大動物實驗中心
17312606166
目的基因過表達，是研究基因功能的主要方法之一。其中，如何確保目的基因準(zhǔn)確無誤的表達是非常關(guān)鍵的一步。因為目的基因表達過量或者在不恰當(dāng)?shù)臅r間表達都會影響到細(xì)胞狀態(tài)或者機體的生長發(fā)育，進而影響實驗結(jié)果。四環(huán)素(Tetracycline, Tet)調(diào)控基因表達系統(tǒng)便可以做到對基因表達的精準(zhǔn)調(diào)控，今天小編便來介紹這一神奇的基因開關(guān)。
四環(huán)素調(diào)控基因表達系統(tǒng)是以大腸桿菌Tn10轉(zhuǎn)座子上Tet抗性操縱子為基礎(chǔ)而建立的。在細(xì)菌系統(tǒng)中，正常情況下，tetR將與tetO結(jié)合，抑制下游抗性基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)存在四環(huán)素或者四環(huán)素類似物如強力霉素時，tetR將與四環(huán)素結(jié)合，不再和tetO結(jié)合，造成下游抗性基因表達，細(xì)菌從而獲得耐藥性[1]。
圖1 TetR和tetO在四環(huán)素耐藥菌中的作用原理[1]
注：在沒有四環(huán)素的情況下，TetR（紫色實心圓）以高親和力與兩個四環(huán)素操縱子tetO1和tetO2 結(jié)合。這導(dǎo)致四環(huán)素外排轉(zhuǎn)運蛋白 TetA 的抑制。如果存在四環(huán)素時（黑色三角形），四環(huán)素與 Mg2+形成復(fù)合物（紅色三角形）。該復(fù)合物與 TetR 結(jié)合，這導(dǎo)致TetR 與tetO分離，TetA得以表達。
由此可見，四環(huán)素誘導(dǎo)基因表達系統(tǒng)的關(guān)鍵元件是四環(huán)素反應(yīng)元件（TRE）和四環(huán)素阻遏蛋白（TetR）。經(jīng)過多年發(fā)展，這一系統(tǒng)也經(jīng)過了多次優(yōu)化，現(xiàn)在常用的TRE是由7個長度為19個氨基酸的四環(huán)素抗性操縱子(TetO)組成，TRE及下游CMV啟動子共同組成了四環(huán)素依賴性啟動子（Ptet）。而對TetR的改造，使得多種Tet調(diào)控系統(tǒng)逐漸發(fā)展起來，應(yīng)用最為廣泛的便是抑制型系統(tǒng)Tet-off和激活型系統(tǒng)Tet-on。
Gossen 和Bujard最初構(gòu)建的系統(tǒng)便是Tet-off系統(tǒng)，即在四環(huán)素存在的情況，目的基因表達水平降低或者不表達。為了達到這一目的，人們對大腸桿菌TetR進行了改造，將皰疹病毒的 VP16 蛋白的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域融合到TetR上，從而合成了反式激活蛋白tTA，改變了TetR阻遏蛋白的屬性。在缺乏四環(huán)素時，tTA 將和TRE結(jié)合，VP16會使Ptet活化從而使基因表達促進目的基因表達，而在四環(huán)素存在時，tTA則與四環(huán)素結(jié)合，抑制目的基因表達[2]。
1995年，Gossen等發(fā)現(xiàn)了tetR參與四環(huán)素誘導(dǎo)的抑制反應(yīng)的關(guān)鍵的4個氨基酸殘基，這些氨基酸殘基突變后可發(fā)生反向的反應(yīng)，即在四環(huán)素存在的條件下，目的基因能夠表達蛋白，而缺失四環(huán)素時，目的基因無法表達。新的反式激活蛋白被稱為rtTA，由rTetR與VP16融合而成[2]。
圖3 Tet-on系統(tǒng)原理
經(jīng)過多年的發(fā)展，人們對Tet-on系統(tǒng)的啟動子和活化因子進行了持續(xù)的優(yōu)化，使目的基因在沒有四環(huán)素的情況下表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性和更低的背景活性，在有四環(huán)素誘導(dǎo)情況下有更高的表達水平。其中，TRE3G和rtTA2 S -M2 變體表現(xiàn)出對四環(huán)素的高敏感性，成為目前廣泛應(yīng)用的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)的元件[3][4]。
圖4 Tet抗性操縱子、Tet-Off和Tet-On系統(tǒng)原理[3]
四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)主要通過pTRE和tTA/rtTA兩部分相互配合完成基因表達調(diào)控的功能。因此，利用四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)在小鼠體內(nèi)實現(xiàn)對目的基因表達的調(diào)控，原則上需要建立兩種小鼠。
首先，建立pTRE小鼠，需將目的基因插入到四環(huán)素依賴性啟動子下游，使目的基因的表達受四環(huán)素的控制。其次，需要建立tTA或者rtTA小鼠，該小鼠中的tTA/rtTA激活因子由特定啟動子驅(qū)動，可在特定細(xì)胞或者組織或者全身表達tTA或者rtTA。
這兩種小鼠繁育后，可獲得子代小鼠中既帶有pTRE及目的基因又帶有tTA/rtTA的小鼠，即可實現(xiàn)通過四環(huán)素的有無來調(diào)控基因的表達。
Tet-off小鼠模型是通過tTA小鼠同pTRE小鼠交配獲得。主要可應(yīng)用于調(diào)控目的基因過表達的水平。例如，Giles等通過構(gòu)建α-MHC-tTA; pTRE-cMyBP-C小鼠，進行了回復(fù)實驗（Rescueexperiments），即將α-MHC-tTA鼠、pTRE-cMyBP-C鼠同cMyBP-C 敲除鼠交配，利用四環(huán)素基因調(diào)控系統(tǒng)在cMyBP-C 敲除小鼠中恢復(fù)cMyBP-C的表達，進而驗證了cMyBP-C缺陷造成的心肌肥大的表型是可逆的。在這一系統(tǒng)中，通過注射四環(huán)素，還可以瞬時降低cMyBP-C的表達。可見，Tet-Off實現(xiàn)可以對基因的功能的全面的研究[5]。
圖5 Tet-off小鼠模型
Tet-On小鼠模型是通過rtTA小鼠同pTRE小鼠交配獲得。主要應(yīng)用于誘導(dǎo)目的基因過表達。例如，Song等通過構(gòu)建Alb-rtTA小鼠，再注射pTRE-uPA腺病毒，制備肝臟損傷模型。Alb是肝臟特異表達的基因，uPA則是肝毒性物質(zhì)，在注射四環(huán)素后，rtTA在Alb啟動子的作用下，將在肝臟中同pTRE結(jié)合，進而過表達下游基因uPA，造成肝臟損傷[6]。
圖6 Tet-on小鼠模型
目前，除四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)以外，科學(xué)家們還開發(fā)了多種條件性基因調(diào)控系統(tǒng)，如Cre-loxp系統(tǒng)、Flp-frt系統(tǒng)、Dre-rox系統(tǒng)等，而四環(huán)素誘導(dǎo)基因表達系統(tǒng)仍具有自己的獨特優(yōu)勢。
首先Tet-On系統(tǒng)在沒有誘導(dǎo)時目的基因的表達水平比較低，誘導(dǎo)時表達水平增高，最高誘導(dǎo)倍數(shù)可達10000倍。
其次原核來源的TetR與TetO的結(jié)合特異性高，哺乳動物細(xì)胞中沒有類似的DNA靶向序列，所以Tet系統(tǒng)調(diào)控特異性高，并且宿主基因不受到影響，適合于體內(nèi)外的各種基因表達的調(diào)控。
同時，Tet系統(tǒng)的誘導(dǎo)藥物為Tet或Dox，Tet作為一種抗生素已被人們應(yīng)用了很長時間，是對人體較為安全的一種藥物，并且在Tet系統(tǒng)中低劑量的Tet就可調(diào)節(jié)基因的表達，所以不會對動物或細(xì)胞產(chǎn)生強毒性。
最后一點是，四環(huán)素系統(tǒng)具有可逆性，在去除誘導(dǎo)劑后可使系統(tǒng)關(guān)閉，也可反復(fù)加入誘導(dǎo)劑，多次啟動誘導(dǎo)反應(yīng)。
南模生物深耕基因編輯領(lǐng)域，在四環(huán)素誘導(dǎo)小鼠模型構(gòu)建上有著成熟的技術(shù)和豐富的經(jīng)驗，為您的基因功能研究之路保駕護航。已有和部分在研的四環(huán)素誘導(dǎo)動物模型信息見下表：
Reference:
[1]2013.igem.org/Team:Bielefeld-Germany/Biosafety/Biosafety_System_M
[2]www.addgene.org/collections/tetracycline
[3] Das AT, Tenenbaum L, Berkhout B. Tet-OnSystems For Doxycycline-inducible Gene Expression. Curr Gene Ther.2016;16(3):156-67.
[4] Loew R,Heinz N, Hampf M, Bujard H, Gossen M. Improved Tet-responsive promoters withminimized background expression. BMC Biotechnol. 2010 Nov 24;10:81.
[5] Giles J,Patel JR, Miller A, Iverson E, Fitzsimons D, Moss RL. Recovery of leftventricular function following in vivo reexpression of cardiac myosin bindingprotein C. J Gen Physiol. 2019 Jan 7;151(1):77-89.
[6] Song X, GuoY, Duo S, Che J, Wu C, Ochiya T, Ding M, Deng H. A mouse model of inducibleliver injury caused by tet-on regulated urokinase for studies of hepatocytetransplantation. Am J Pathol. 2009 Nov;175(5):1975-83.
| 上一篇：補體丨免疫藥物的下一站榮光（附動物模型） | 下一篇：實驗小鼠的培育在飼料、運輸方面都有嚴(yán)格的要求，且要做好小鼠的記錄 |
|
|
|
