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手足口病是腸道病毒引起的傳染性、出疹性疾病，該病多發(fā)生于5歲以下的嬰幼兒，可引起發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹、潰瘍，個(gè)別手足口病患者可引起心肌炎、肺水腫、無(wú)菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥，而神經(jīng)源性肺水腫、肺出血和心力衰竭被認(rèn)為是導(dǎo)致死亡的主要原因。
引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種，包括柯薩奇病毒A組和B組、人腸道病毒71型（human enterovirus 71，EV71）以及皰疹病毒、腺病毒等，其中以柯薩奇病毒A16型(coxsackievirus A16，CA16)和腸道病毒71型（EV71）最為常見(jiàn)。而絕大多數(shù)重癥手足口病病例，均由EV71或CA16病毒感染所致。
EV71屬于微小RNA病毒科，腸道病毒屬，主要通過(guò)糞口傳播，病毒最初定植于鼻咽部或胃腸道粘膜，侵入淋巴組織并在其中繁殖，進(jìn)而引起第一次病毒血癥。若機(jī)體免疫力差，病毒可擴(kuò)散至全身組織器官，大量繁殖后再次入血，引起第二次病毒血癥，最終侵犯靶器官，如腦、腦膜、脊髓、心肌和橫紋肌以及皮膚黏膜組織，引起重癥病變，其主要病變?yōu)樯窠?jīng)元壞死等。
PSGL-1（P-selectin glycoprotein ligand-1）蛋白是一種糖蛋白，作為細(xì)胞粘附分子P-、E-、L-選擇素的高親和力反受體，參與了炎癥反應(yīng)過(guò)程中免疫細(xì)胞的遷移。同時(shí)，有研究表明PSGL-1也是人EV71病毒的受體，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表達(dá)人PSGL-1蛋白可以提高細(xì)胞對(duì)EV71的敏感性。由于目前的EV71小鼠模型采用乳鼠（14日齡以內(nèi)），可用于感染研究的周期太短，且其免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟，限制了該模型在研究EV71致病機(jī)理中的應(yīng)用。
中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所劉江寧教授課題組通過(guò)建立表達(dá)人PSGL-1的轉(zhuǎn)基因小鼠，以提高小鼠對(duì)EV71病毒的敏感性，從而有望提高敏感小鼠的年齡，建立成年的EV71感染模型。
課題組以人PSGL-1的mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得人PSGL-1的cDNA，將其插入pCDNA3.1(+)載體的啟動(dòng)子下游，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體。載體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后，將其線性化并經(jīng)顯微注射到C57BL/6J的受精卵中，用129做假孕受體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠。人PSGl-1轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)RT-PCR和Western blotting鑒定，表明人PSGL-1蛋白主要在小鼠的骨骼肌和腦中表達(dá)，可檢測(cè)到該基因的mRNA表達(dá)及蛋白（圖1）。
對(duì)10日齡人PSGl-1轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射感染EV71 病毒的小鼠適應(yīng)株MP10（GenBank：HQ712020）5×106 TCID50。動(dòng)物自感染后第3天開(kāi)始出現(xiàn)癥狀，表現(xiàn)為體重增長(zhǎng)變緩、弓背豎毛、后肢行動(dòng)遲緩至癱瘓、死亡等癥狀。感染后第4天時(shí)，動(dòng)物全部表現(xiàn)出后肢癱瘓、停止進(jìn)食等癥狀，感染后第5天動(dòng)物開(kāi)始出現(xiàn)死亡，在10天內(nèi)全部死亡，該特征類似于EV71重癥感染小鼠模型。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)表明病毒主要復(fù)制部位為骨骼肌和腦，病毒在感染后第3天達(dá)到高峰，主要病理表現(xiàn)為壞死性肌炎。
相對(duì)于野生型小鼠，感染后第3天，PSGL-1轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌、脊髓和腦內(nèi)的病毒載量顯著高于野生型小鼠（圖2A-C），但是在第5天時(shí)，該差別不再明顯，表明表達(dá)人PSGL-1蛋白可以一過(guò)性的促進(jìn)EV71小鼠適應(yīng)株感染小鼠。與病毒復(fù)制相一致，第3天轉(zhuǎn)基因小鼠的后肢出現(xiàn)雙側(cè)癱瘓，癥狀明顯比野生型小鼠嚴(yán)重，但在第5天時(shí)癥狀類似（圖2D-E）。提高病毒的感染劑量，并不能使兩周以上的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出明顯的癥狀，表明人PSGL-1具有一定的促進(jìn)EV71感染效果。
圖1. 人PSGL-1轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定.A，人PSGL-1基因設(shè)計(jì)；B，轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定；C，骨骼肌和腦內(nèi)人PSGL-1基因的mRNA檢測(cè)；D，Western blotting檢測(cè)骨骼肌和腦內(nèi)人PSGL-1蛋白表達(dá)檢測(cè)。
圖2. EV71的小鼠適應(yīng)株MP10感染轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠. A-C，組織內(nèi)病毒載量，A（骨骼?。?，B（脊髓），C（腦）；D，臨床癥狀評(píng)分的變化曲線；E，感染第3天和第5天時(shí)的小鼠狀態(tài)照片。
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參考文獻(xiàn)：
Jiangning Liu, Wei Dong, Xiongzhi Quan, Chunmei Ma, Chuan Qin, Lianfeng Zhang. Transgenic expression of human P-selectin glycoprotein ligand-1 is not sufficient for enterovirus 71 infection in mice. Arch Virol (2012) 157: 539-543.
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